原代培养技术

一、实验材料准备 
 

1.  动物
 

出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。

2.   试剂
 

低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。

3.   手术器械和仪器
 

铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和 50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。

二、方法
 

1.   将胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的浓度，并放置于 37℃水浴中温育好。

2.  解剖取材：将乳鼠放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重复以上过程。取材完毕后，撤掉取材的手术器械。

注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

3.   用第二套手术器械进行下列操作。用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许 0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成 1mm³大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。打开磁力搅拌器电源，预先将水温调节到 37℃)，调节转速至 60 rpm左右，消化15 min(务必保证水浴温度恒定在 37℃，并且消化时间不超过 15 min)。或者，如果采用的是水浴震荡器的话，不用加搅拌子，直接放在水浴震荡器中消化亦可，转速和消化时间相同。

4.  从水浴中取出锥形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血红细胞和成纤维类细胞。

5.    加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液几次，机械分散细胞(组织消化后会成为粘稠的胶体状)，注意：不要过分吹打，否则会导致组织过度消化，37℃水浴搅拌再消化 10-15 min；如果乳鼠数目少(比如 5、6 只的时候)，消化时间可以减少为 5-10 min，否则很容易消化过度。上述消化处理的同时，往一支 50 ml 的一次性无菌离心管中加入 20 ml 预冷的含 10%血清的培养液，并放置冰台上。消化处理之后，小心移出上清转至上述加有培养液的离心管中，第一次消化收集的分离出的细胞，第一次消化结束后；继续第二次消化，余下的组织块加入 10 ml 新胰酶继续消化。

6.  重复 5 消化步骤，直至剩余少许组织块为止，一般消化 4-5 次可以消化绝大多数的组织块(不含弃去消化液的那次)。

7.  第 1、2 次含细胞的消化液放在一根离心管中，过 180 目筛网后，一起离心；第 3、4 次含细胞的消化液放在一根离心管中，过 180 目筛网后，一起离心。最后，分别用 8 ml含 20%血清的培养液重悬两管细胞，接种到一个 75 cm²的塑料培养瓶中，放置在培养箱中 1.5 小时后，取出，弃贴壁细胞(主要是成纤维细胞和内皮细胞)，将未贴壁的细胞悬液取出，台盼篮拒染法计数后，加入培养液调整细胞浓度为5-6x10⁵个/ml，接种到目的培养器皿中。

5.    一般不用加BrdU，如果培养时间长(发现成纤维细胞也极少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纤维细胞增殖。加了BrdU，心肌细胞搏动的持续时间会更长。

9.    接种后 24 小时，用温的培养基或者平衡盐液轻轻冲洗培养的心肌细胞一次，以去处未贴壁的细胞(部分细胞会在 24 小时后贴，结果很多细胞重叠生长)，再更换培养液，即可。可以按照实验需要在培养 48 h 或 72 h 后施加处理因素。

三、 结果
 

心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在 24 h左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好， DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充。鉴定的最简单的办法就是搏动与否，注意：当搏动比较微弱的时候，在 10 倍物镜下可能看不到搏动，换成20 或40倍的物镜可能能观察到。检验操作是否合格的最好的办法就是看心肌细胞的纯度和搏动能力。另外，心肌细胞表达肌动蛋白，可以作为鉴定，但不是唯一的特征性指标，因为平滑肌细胞也表达。

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小，但这个浓度消化所需时间较长。采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁 1.5 h，充分去除成纤维类细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状，并且会增殖，不搏动，很好和心肌细胞鉴别。消化和吹打一定不要过度，是保证心肌细胞活力最重要的一个原则。而接种密度(一般不低于 10⁵/ml)，也将影响到心肌细胞的搏动及同步化搏动。

心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在 24 h左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好， DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充。鉴定的最简单的办法就是搏动与否，注意：当搏动比较微弱的时候，在 10 倍物镜下可能看不到搏动，换成20 或40倍的物镜可能能观察到。检验操作是否合格的最好的办法就是看心肌细胞的纯度和搏动能力。另外，心肌细胞表达肌动蛋白，可以作为鉴定，但不是唯一的特征性指标，因为平滑肌细胞也表达。