材料与仪器
人食管癌细胞系
胰酶 RNA酶 碘化丙啶 四甲基偶氮唑盐 小牛血清 DMEM DMSO K2HPO4 Na2HPO4 NaCI
无菌分选管 400目细胞筛 水浴锅 离心机 酶标仪 电泳仪 显微镜 PCR仪
胰酶 RNA酶 碘化丙啶 四甲基偶氮唑盐 小牛血清 DMEM DMSO K2HPO4 Na2HPO4 NaCI
无菌分选管 400目细胞筛 水浴锅 离心机 酶标仪 电泳仪 显微镜 PCR仪
步骤
一、材料准备
2. 链霉素储存液
（1）将键霉素小瓶中的1 mg干粉充分溶解于10 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
3. RPMI 1640培养基
（1）在大三角瓶中装入800 ml 去离子水。
（2）加入1袋RPMI1640干粉制荆，于搅拌器上混匀。
（3）加入2.0 g Na2HCO3，1 ml 10万unit/ml 的青霉素储存液。
（4）1 ml 充分溶解后，调节pH值至7.4，去离子水定容为1000 ml。
（5）无菌条件下0.22 um 孔径滤膜过滤后分装置于4℃保存。
4. UltraMEM培养液
（1）500 ml UltraMEM中加入无菌的10 ng/ml bFGF、10 ng/ml EGF、50U/ml青霉素和50 ug/ml 链霉素，4℃保存。
（2）由于完全无血清状态不利于细胞生长，我们在该培养液中加入5%的FBS，维持FBS呈较低水平。
5. 1×PBS （pH 7.4）
（1）在800 ml去离子水中溶解1.15g Na2HPO4、0.2 g K2HPO4、8.0 g NaCl和0.2 g KCl。
（2）用1 M HC1调pH值至7.4，加水定容为1000 ml。
6. EGF：用1 ml 无菌水溶解安培内的100 ug EGF，分成10管，取1管稀释100倍分装成小份作为工作液，其余9管作为贮藏液，均置于-20℃保存。
7. bFGF
（1）用1 ml Tris缓冲液充分溶解安培内的10 ug bFGF
（2）分装成10管，每管以PBS稀释10倍后分装成小份作为工作液，置于-20℃保存。
8. 0.25%胰酶
（1）称取胰酶0.25 g，以1x PBS 100 ml溶解。
（2）无菌条件下0.22 um 孔径滤膜过滤后置于4℃保存。
9. 5 mg/ml 四甲基偶氮唑盐（MTT）
（1）0.5 g MTT粉剂加入100 ml PBS浴液中充分溶解。
（2）无菌条件下0.22um孔径滤膜过滤后分装置于-20℃保存。
10. 细胞冻存液：DMSO：FBS=1：9，-20℃保存。
11. Hoechst 33342
（1）将10 mg Hoechst 33342粉剂以无菌水1ml 溶解作为贮存液。
（2）取出10 ul稀释到40 ul作为工作液，二者均避光，-20℃保存。
12. 碘化丙啶（PI）
（1）将25 mg PI粉剂以1×PBS缓冲液250 ml 避光搅拌至充分溶解。
（2）得到终浓度为l00 ug/ml 的贮存液，过滤分装后置于4℃避光保存。
13. 10 mg/ml RNA酶
（1）将胰RNA酶溶解于溶剂中[10 mM Tris-HCl（pH 7.5），15 mM NaCl]，浓度为10 mg/ml。
（2）置于100℃15 min，缓慢冷却至室温后分装为200 ul/支，保存于-20℃。
14. Verapamil配制
（1）用DMSO配浓度为50 mg/ml 的原液。
（2）从文献得知应用液的浓度是100 umol/ml。
（3）所以将原液稀释50倍后就可以得到浓度为100 umol/ml应用浓度。
（4）实验中按照每ml细胞悬液中加入10 uL 的原液即可达到阻断离予通道所需的浓度。
二、实验步骤
1. 流式细胞仪分选方法：
（1） 0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的鼻咽癌细胞，1200 rpm/min，离心5 min，弃上清后加入5 ml PBS重悬细胞，离心洗涤两次。
（3）加入浓度为7.5 ug/ul 的荧光染料Hoechst 33342至终浓度5 ug/ml，避光，于37℃培养箱中孵育90分钟，间断混匀以免细胞沉底。
（4）低温离心，4℃，1200 rpm/min，5 min，弃上清。
（5）2 ml PBS重悬，1200 rpm/min，5 min。
（6）用2~4 ml RPMI1640培养液重悬细胞，以400目高压灭菌后的细胞筛过筛细胞，除去粘连细胞团。
（7）于上流式细胞仪前5分钟加入浓度为50 ug/ml 的PI达到终浓度为1~2 ug/ml，避光标记细胞。
（8）上机分析或分选。
2. 结晶紫染色步骤：
（1）用PBS清洗每孔两次，去除培养液中的蛋白成份。
（2）每孔加入1.5 ml 100%乙醇，室温固定15分钟。
（3）PBS清洗两次，每孔加入1 ml 4%的结晶紫染料．室温作用15分钟。
（4）流水缓慢洗去多余染料，于吸水纸上控干水分，计数细胞数大于50个的克隆数量并计算CFE。
3. 多向分化以及自我更新能力研究：
（1）分选后SP和NSP细胞分别接种于培养瓶中。
（2）培养2周，达到再次分析的细胞数目后收集细胞做Hoechst 33342染色，分析SP细胞比例高低。’
4. 细胞总RNA提取：
（1）采用Trizol Reagent提取细胞RNA。取生长状态良好的SP和NSP细胞，弃去培养液，0.25%的胰酶消化细胞，用无菌PBS洗2次，加入1 ml Trizol，带细胞裂解后移入EP管，室温静置5 min。
（2）加入0.3 ml 氯仿，颠倒混匀EP管15 sec，室温静置3 min，4℃12 000 g离心10 min，缓慢吸取上清于另一EP管中。
（3）加入0.75 ml异丙醇，混匀，室温静置10 min，4℃12 000 g离心10 min，弃上清。
（4）加入75%乙醇（用DEPC处理过的去离子水来配制），混合，4℃，7 500 g 离心5 min，弃上清。
（5）室温干燥，加入20 ul 经DEPC处理去离子水，55℃~60℃水浴10 min 助融，以1：25稀释后检测260：280比值以及RNA浓度，分装，-80℃冰箱保存备用。
5. 小鼠体内成瘤试验
（1）先用未分选的EC-9706细胞做预实验来确定接种细胞数目，选取地数量分别为1×106，1×105和1×104，四周后观察肿瘤形成情况。
（2）将当天上午分选所得到的SP和NSP细胞准确圮数后重悬于RPMI-1640培养液中，分6组接种细胞，接种体积为100 ul。
（4）饲养4~9周，每周观察两次肿瘤生长情况。
（5）处死前用游标卡尺测量肿瘤大小，采取断颈法处死小鼠，拍照取出瘤组织。
（6）剪取部分用10%福尔马林浸泡固定，切片进行HE染色确定病理类型。
6. Western Blot分析目的蛋白：
（1）细胞总蛋白的提取
①准备冰盒，以下操作尽量在冰上完成。
②用冰预冷的PBS洗去细胞培养皿中残余的培养液。
③加入1 ml PBS，用细胞刮将细胞刮下，收集于EP管中，1500 rpm/min，离心5 min 或者1800 rpm/min，离心3 min。
④缓慢吸去上清液，于下层细胞沉淀中加入1 ml 细胞裂解液将细胞裂解，混匀后于冰上放置至少45 min，然后于低温超速离心机上4℃，12000 m/min，离心5 min。
⑤吸取上清，分装并检测蛋白浓度。
（2）标准曲线的绘制以及样品蛋白的浓度测定
①BSA蛋白标准品的稀释：将浓度为2000 ug/ml 的原液逐步稀释得到浓度分别为1500 ug/m，1000 ug/m，750 ug/m，500 ug/m，250 ug/m，125 ug/m和25 ug/ml的标准品梯度。
③取5 ul 标准品或样品，加100 ul 的工作液，室温混匀30秒。
④37℃孵育30 min 后降至室温，于570 nm 波长下测OD值，绘制标准曲线并根据稀释倍数计算蛋白样品的浓度。
（1）小心将处理好的盖玻片用镊子夹住放入六孔板板中，将分选收到的SP和NSP细胞分别滴加到片子上，利用表面张力将液滴控制在片子范围内，静置20~30 min，待细胞贴壁后轻轻补加培养液（注意不要使片子浮起），放入培养箱中培养过夜。
（2）次日，弃去孔中培养液，PBS洗3次，加入10%甲醛，4℃固定30 min。
（3）PBS洗3次去除多聚甲醛，每孔加入1 ml 5%牛血清白蛋白室温孵育2 h 封闭，阻断非特异性IgG结合。
（4）PBS洗2次，加入适量CD44和CK18一抗，放置于摇床上4℃过夜。
（5）用PBS-T（含有0.02%Tween 20的PBS）洗涤3次，加入荧光二抗适量，放入暗盒中，置于摇床上室温结合2小时。
（6）PBS-T洗涤3次，用含有0.5 mg/ml DAPI 的封片液将盖玻片固定于载玻片上，放入暗盒中避光保存。
（7）于Olympus正置荧光显微镜下观察细胞荧光强度，记录拍照。
1. 青霉素储存液
（1）将青霉素小瓶中的80万单位的干粉充分溶解于8 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
（1）将青霉素小瓶中的80万单位的干粉充分溶解于8 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
2. 链霉素储存液
（1）将键霉素小瓶中的1 mg干粉充分溶解于10 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
3. RPMI 1640培养基
（1）在大三角瓶中装入800 ml 去离子水。
（2）加入1袋RPMI1640干粉制荆，于搅拌器上混匀。
（3）加入2.0 g Na2HCO3，1 ml 10万unit/ml 的青霉素储存液。
（4）1 ml 充分溶解后，调节pH值至7.4，去离子水定容为1000 ml。
（5）无菌条件下0.22 um 孔径滤膜过滤后分装置于4℃保存。
4. UltraMEM培养液
（1）500 ml UltraMEM中加入无菌的10 ng/ml bFGF、10 ng/ml EGF、50U/ml青霉素和50 ug/ml 链霉素，4℃保存。
（2）由于完全无血清状态不利于细胞生长，我们在该培养液中加入5%的FBS，维持FBS呈较低水平。
5. 1×PBS （pH 7.4）
（1）在800 ml去离子水中溶解1.15g Na2HPO4、0.2 g K2HPO4、8.0 g NaCl和0.2 g KCl。
（2）用1 M HC1调pH值至7.4，加水定容为1000 ml。
6. EGF：用1 ml 无菌水溶解安培内的100 ug EGF，分成10管，取1管稀释100倍分装成小份作为工作液，其余9管作为贮藏液，均置于-20℃保存。
7. bFGF
（1）用1 ml Tris缓冲液充分溶解安培内的10 ug bFGF
（2）分装成10管，每管以PBS稀释10倍后分装成小份作为工作液，置于-20℃保存。
8. 0.25%胰酶
（1）称取胰酶0.25 g，以1x PBS 100 ml溶解。
（2）无菌条件下0.22 um 孔径滤膜过滤后置于4℃保存。
9. 5 mg/ml 四甲基偶氮唑盐（MTT）
（1）0.5 g MTT粉剂加入100 ml PBS浴液中充分溶解。
（2）无菌条件下0.22um孔径滤膜过滤后分装置于-20℃保存。
10. 细胞冻存液：DMSO：FBS=1：9，-20℃保存。
11. Hoechst 33342
（1）将10 mg Hoechst 33342粉剂以无菌水1ml 溶解作为贮存液。
（2）取出10 ul稀释到40 ul作为工作液，二者均避光，-20℃保存。
12. 碘化丙啶（PI）
（1）将25 mg PI粉剂以1×PBS缓冲液250 ml 避光搅拌至充分溶解。
（2）得到终浓度为l00 ug/ml 的贮存液，过滤分装后置于4℃避光保存。
13. 10 mg/ml RNA酶
（1）将胰RNA酶溶解于溶剂中[10 mM Tris-HCl（pH 7.5），15 mM NaCl]，浓度为10 mg/ml。
（2）置于100℃15 min，缓慢冷却至室温后分装为200 ul/支，保存于-20℃。
14. Verapamil配制
（1）用DMSO配浓度为50 mg/ml 的原液。
（2）从文献得知应用液的浓度是100 umol/ml。
（3）所以将原液稀释50倍后就可以得到浓度为100 umol/ml应用浓度。
（4）实验中按照每ml细胞悬液中加入10 uL 的原液即可达到阻断离予通道所需的浓度。
二、实验步骤
1. 流式细胞仪分选方法：
（1） 0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的鼻咽癌细胞，1200 rpm/min，离心5 min，弃上清后加入5 ml PBS重悬细胞，离心洗涤两次。
（2）以冰预冷的含2% FBS RPMI 1640完全培养液重悬细胞，调整浓度为1×106个/ml，于37℃培养箱中孵育10分钟。
（3）加入浓度为7.5 ug/ul 的荧光染料Hoechst 33342至终浓度5 ug/ml，避光，于37℃培养箱中孵育90分钟，间断混匀以免细胞沉底。
（4）低温离心，4℃，1200 rpm/min，5 min，弃上清。
（5）2 ml PBS重悬，1200 rpm/min，5 min。
（6）用2~4 ml RPMI1640培养液重悬细胞，以400目高压灭菌后的细胞筛过筛细胞，除去粘连细胞团。
（7）于上流式细胞仪前5分钟加入浓度为50 ug/ml 的PI达到终浓度为1~2 ug/ml，避光标记细胞。
（8）上机分析或分选。
2. 结晶紫染色步骤：
（1）用PBS清洗每孔两次，去除培养液中的蛋白成份。
（2）每孔加入1.5 ml 100%乙醇，室温固定15分钟。
（3）PBS清洗两次，每孔加入1 ml 4%的结晶紫染料．室温作用15分钟。
（4）流水缓慢洗去多余染料，于吸水纸上控干水分，计数细胞数大于50个的克隆数量并计算CFE。
3. 多向分化以及自我更新能力研究：
（1）分选后SP和NSP细胞分别接种于培养瓶中。
（2）培养2周，达到再次分析的细胞数目后收集细胞做Hoechst 33342染色，分析SP细胞比例高低。’
4. 细胞总RNA提取：
（1）采用Trizol Reagent提取细胞RNA。取生长状态良好的SP和NSP细胞，弃去培养液，0.25%的胰酶消化细胞，用无菌PBS洗2次，加入1 ml Trizol，带细胞裂解后移入EP管，室温静置5 min。
（2）加入0.3 ml 氯仿，颠倒混匀EP管15 sec，室温静置3 min，4℃12 000 g离心10 min，缓慢吸取上清于另一EP管中。
（3）加入0.75 ml异丙醇，混匀，室温静置10 min，4℃12 000 g离心10 min，弃上清。
（4）加入75%乙醇（用DEPC处理过的去离子水来配制），混合，4℃，7 500 g 离心5 min，弃上清。
（5）室温干燥，加入20 ul 经DEPC处理去离子水，55℃~60℃水浴10 min 助融，以1：25稀释后检测260：280比值以及RNA浓度，分装，-80℃冰箱保存备用。
5. 小鼠体内成瘤试验
（1）先用未分选的EC-9706细胞做预实验来确定接种细胞数目，选取地数量分别为1×106，1×105和1×104，四周后观察肿瘤形成情况。
（2）将当天上午分选所得到的SP和NSP细胞准确圮数后重悬于RPMI-1640培养液中，分6组接种细胞，接种体积为100 ul。
（3）于4℃保存在动物房中分别注射于NOD/SCID小鼠腋下，每个剂量3只小鼠，SP和NSP细胞共24只小鼠。
（4）饲养4~9周，每周观察两次肿瘤生长情况。
（5）处死前用游标卡尺测量肿瘤大小，采取断颈法处死小鼠，拍照取出瘤组织。
（6）剪取部分用10%福尔马林浸泡固定，切片进行HE染色确定病理类型。
6. Western Blot分析目的蛋白：
（1）细胞总蛋白的提取
①准备冰盒，以下操作尽量在冰上完成。
②用冰预冷的PBS洗去细胞培养皿中残余的培养液。
③加入1 ml PBS，用细胞刮将细胞刮下，收集于EP管中，1500 rpm/min，离心5 min 或者1800 rpm/min，离心3 min。
④缓慢吸去上清液，于下层细胞沉淀中加入1 ml 细胞裂解液将细胞裂解，混匀后于冰上放置至少45 min，然后于低温超速离心机上4℃，12000 m/min，离心5 min。
⑤吸取上清，分装并检测蛋白浓度。
（2）标准曲线的绘制以及样品蛋白的浓度测定
①BSA蛋白标准品的稀释：将浓度为2000 ug/ml 的原液逐步稀释得到浓度分别为1500 ug/m，1000 ug/m，750 ug/m，500 ug/m，250 ug/m，125 ug/m和25 ug/ml的标准品梯度。
②配制工作液：按照使用说明将A液50体积与B液1体积混合。
③取5 ul 标准品或样品，加100 ul 的工作液，室温混匀30秒。
④37℃孵育30 min 后降至室温，于570 nm 波长下测OD值，绘制标准曲线并根据稀释倍数计算蛋白样品的浓度。
7. 免疫荧光法分析细胞蛋白分子表达：
（1）小心将处理好的盖玻片用镊子夹住放入六孔板板中，将分选收到的SP和NSP细胞分别滴加到片子上，利用表面张力将液滴控制在片子范围内，静置20~30 min，待细胞贴壁后轻轻补加培养液（注意不要使片子浮起），放入培养箱中培养过夜。
（2）次日，弃去孔中培养液，PBS洗3次，加入10%甲醛，4℃固定30 min。
（3）PBS洗3次去除多聚甲醛，每孔加入1 ml 5%牛血清白蛋白室温孵育2 h 封闭，阻断非特异性IgG结合。
（4）PBS洗2次，加入适量CD44和CK18一抗，放置于摇床上4℃过夜。
（5）用PBS-T（含有0.02%Tween 20的PBS）洗涤3次，加入荧光二抗适量，放入暗盒中，置于摇床上室温结合2小时。
（6）PBS-T洗涤3次，用含有0.5 mg/ml DAPI 的封片液将盖玻片固定于载玻片上，放入暗盒中避光保存。
（7）于Olympus正置荧光显微镜下观察细胞荧光强度，记录拍照。
来源：丁香实验
