材料与仪器
人食管癌细胞系
胰酶 RNA酶 碘化丙啶 四甲基偶氮唑盐 小牛血清 DMEM DMSO K2HPO4 Na2HPO4 NaCI
无菌分选管 400目细胞筛 水浴锅 离心机 酶标仪 电泳仪 显微镜 PCR仪
步骤
一、材料准备
1. 青霉素储存液
（1）将青霉素小瓶中的80万单位的干粉充分溶解于8 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
（1）将青霉素小瓶中的80万单位的干粉充分溶解于8 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
2. 链霉素储存液
（1）将键霉素小瓶中的1 mg干粉充分溶解于10 ml去离子水中。
（2）分装为1 ml/管，-20℃保存。
3. RPMI 1640培养基
（1）在大三角瓶中装入800 ml 去离子水。
（2）加入1袋RPMI1640干粉制荆，于搅拌器上混匀。
（3）加入2.0 g Na2HCO3，1 ml 10万unit/ml 的青霉素储存液。
（4）1 ml 充分溶解后，调节pH值至7.4，去离子水定容为1000 ml。
（5）无菌条件下0.22 um 孔径滤膜过滤后分装置于4℃保存。
4. UltraMEM培养液
（1）500 ml UltraMEM中加入无菌的10 ng/ml bFGF、10 ng/ml EGF、50U/ml青霉素和50 ug/ml 链霉素，4℃保存。
（2）由于完全无血清状态不利于细胞生长，我们在该培养液中加入5%的FBS，维持FBS呈较低水平。
5. 1×PBS （pH 7.4）
（1）在800 ml去离子水中溶解1.15g Na2HPO4、0.2 g K2HPO4、8.0 g NaCl和0.2 g KCl。
（2）用1 M HC1调pH值至7.4，加水定容为1000 ml。
6. EGF：用1 ml 无菌水溶解安培内的100 ug EGF，分成10管，取1管稀释100倍分装成小份作为工作液，其余9管作为贮藏液，均置于-20℃保存。
7. bFGF
（1）用1 ml Tris缓冲液充分溶解安培内的10 ug bFGF
（2）分装成10管，每管以PBS稀释10倍后分装成小份作为工作液，置于-20℃保存。
8. 0.25%胰酶
（1）称取胰酶0.25 g，以1x PBS 100 ml溶解。
（2）无菌条件下0.22 um 孔径滤膜过滤后置于4℃保存。
9. 5 mg/ml 四甲基偶氮唑盐（MTT）
（1）0.5 g MTT粉剂加入100 ml PBS浴液中充分溶解。
（2）无菌条件下0.22um孔径滤膜过滤后分装置于-20℃保存。
10. 细胞冻存液：DMSO：FBS=1：9，-20℃保存。
11. Hoechst 33342
（1）将10 mg Hoechst 33342粉剂以无菌水1ml 溶解作为贮存液。
（2）取出10 ul稀释到40 ul作为工作液，二者均避光，-20℃保存。
12. 碘化丙啶（PI）
（1）将25 mg PI粉剂以1×PBS缓冲液250 ml 避光搅拌至充分溶解。
（2）得到终浓度为l00 ug/ml 的贮存液，过滤分装后置于4℃避光保存。
13. 10 mg/ml RNA酶
（1）将胰RNA酶溶解于溶剂中[10 mM Tris-HCl（pH 7.5），15 mM NaCl]，浓度为10 mg/ml。
（2）置于100℃15 min，缓慢冷却至室温后分装为200 ul/支，保存于-20℃。
14. Verapamil配制
（1）用DMSO配浓度为50 mg/ml 的原液。
（2）从文献得知应用液的浓度是100 umol/ml。
（3）所以将原液稀释50倍后就可以得到浓度为100 umol/ml应用浓度。
（4）实验中按照每ml细胞悬液中加入10 uL 的原液即可达到阻断离予通道所需的浓度。
二、实验步骤
1. 流式细胞仪分选方法：
（1） 0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的鼻咽癌细胞，1200 rpm/min，离心5 min，弃上清后加入5 ml PBS重悬细胞，离心洗涤两次。
（2）以冰预冷的含2% FBS RPMI 1640完全培养液重悬细胞，调整浓度为1×106个/ml，于37℃培养箱中孵育10分钟。
（3）加入浓度为7.5 ug/ul 的荧光染料Hoechst 33342至终浓度5 ug/ml，避光，于37℃培养箱中孵育90分钟，间断混匀以免细胞沉底。
（4）低温离心，4℃，1200 rpm/min，5 min，弃上清。
（5）2 ml PBS重悬，1200 rpm/min，5 min。
（6）用2~4 ml RPMI1640培养液重悬细胞，以400目高压灭菌后的细胞筛过筛细胞，除去粘连细胞团。
（7）于上流式细胞仪前5分钟加入浓度为50 ug/ml 的PI达到终浓度为1~2 ug/ml，避光标记细胞。
（8）上机分析或分选。
2. 结晶紫染色步骤：
（1）用PBS清洗每孔两次，去除培养液中的蛋白成份。
（2）每孔加入1.5 ml 100%乙醇，室温固定15分钟。
（3）PBS清洗两次，每孔加入1 ml 4%的结晶紫染料．室温作用15分钟。
（4）流水缓慢洗去多余染料，于吸水纸上控干水分，计数细胞数大于50个的克隆数量并计算CFE。
3. 多向分化以及自我更新能力研究：
（1）分选后SP和NSP细胞分别接种于培养瓶中。
（2）培养2周，达到再次分析的细胞数目后收集细胞做Hoechst 33342染色，分析SP细胞比例高低。’
4. 细胞总RNA提取：
（1）采用Trizol Reagent提取细胞RNA。取生长状态良好的SP和NSP细胞，弃去培养液，0.25%的胰酶消化细胞，用无菌PBS洗2次，加入1 ml Trizol，带细胞裂解后移入EP管，室温静置5 min。
（2）加入0.3 ml 氯仿，颠倒混匀EP管15 sec，室温静置3 min，4℃12 000 g离心10 min，缓慢吸取上清于另一EP管中。
（3）加入0.75 ml异丙醇，混匀，室温静置10 min，4℃12 000 g离心10 min，弃上清。
（4）加入75%乙醇（用DEPC处理过的去离子水来配制），混合，4℃，7 500 g 离心5 min，弃上清。
（5）室温干燥，加入20 ul 经DEPC处理去离子水，55℃~60℃水浴10 min 助融，以1：25稀释后检测260：280比值以及RNA浓度，分装，-80℃冰箱保存备用。
5. 小鼠体内成瘤试验
（1）先用未分选的EC-9706细胞做预实验来确定接种细胞数目，选取地数量分别为1×106，1×105和1×104，四周后观察肿瘤形成情况。
（2）将当天上午分选所得到的SP和NSP细胞准确圮数后重悬于RPMI-1640培养液中，分6组接种细胞，接种体积为100 ul。
（3）于4℃保存在动物房中分别注射于NOD/SCID小鼠腋下，每个剂量3只小鼠，SP和NSP细胞共24只小鼠。
（4）饲养4~9周，每周观察两次肿瘤生长情况。
（5）处死前用游标卡尺测量肿瘤大小，采取断颈法处死小鼠，拍照取出瘤组织。
（6）剪取部分用10%福尔马林浸泡固定，切片进行HE染色确定病理类型。
6. Western Blot分析目的蛋白：
（1）细胞总蛋白的提取
①准备冰盒，以下操作尽量在冰上完成。
②用冰预冷的PBS洗去细胞培养皿中残余的培养液。
③加入1 ml PBS，用细胞刮将细胞刮下，收集于EP管中，1500 rpm/min，离心5 min 或者1800 rpm/min，离心3 min。
④缓慢吸去上清液，于下层细胞沉淀中加入1 ml 细胞裂解液将细胞裂解，混匀后于冰上放置至少45 min，然后于低温超速离心机上4℃，12000 m/min，离心5 min。
⑤吸取上清，分装并检测蛋白浓度。
（2）标准曲线的绘制以及样品蛋白的浓度测定
①BSA蛋白标准品的稀释：将浓度为2000 ug/ml 的原液逐步稀释得到浓度分别为1500 ug/m，1000 ug/m，750 ug/m，500 ug/m，250 ug/m，125 ug/m和25 ug/ml的标准品梯度。
②配制工作液：按照使用说明将A液50体积与B液1体积混合。
③取5 ul 标准品或样品，加100 ul 的工作液，室温混匀30秒。
④37℃孵育30 min 后降至室温，于570 nm 波长下测OD值，绘制标准曲线并根据稀释倍数计算蛋白样品的浓度。
7. 免疫荧光法分析细胞蛋白分子表达：
（1）小心将处理好的盖玻片用镊子夹住放入六孔板板中，将分选收到的SP和NSP细胞分别滴加到片子上，利用表面张力将液滴控制在片子范围内，静置20~30 min，待细胞贴壁后轻轻补加培养液（注意不要使片子浮起），放入培养箱中培养过夜。
（2）次日，弃去孔中培养液，PBS洗3次，加入10%甲醛，4℃固定30 min。
（3）PBS洗3次去除多聚甲醛，每孔加入1 ml 5%牛血清白蛋白室温孵育2 h 封闭，阻断非特异性IgG结合。
（4）PBS洗2次，加入适量CD44和CK18一抗，放置于摇床上4℃过夜。
（5）用PBS-T（含有0.02%Tween 20的PBS）洗涤3次，加入荧光二抗适量，放入暗盒中，置于摇床上室温结合2小时。
（6）PBS-T洗涤3次，用含有0.5 mg/ml DAPI 的封片液将盖玻片固定于载玻片上，放入暗盒中避光保存。
（7）于Olympus正置荧光显微镜下观察细胞荧光强度，记录拍照。
来源：丁香实验
![PBS [10X]（磷酸盐缓冲液）（80mM Na2HPO4、1.5M NaCl、20mM KH2PO4、30mM KCl、pH 7.4）|PBS [10X] (Phosphate Buffered Saline) (80mM Na2HPO4, 1.5M NaCl, 20mM KH2PO4, 30mM KCl, pH 7.4)](https://img1.dxycdn.com/2022/0720/389/4090233263387411653-14.jpg!wh200)
