细胞培养技术

第一节 培养细胞学 cultural cytology

何谓是培养细胞学？

指细胞在体外培养的特定条件下，通过对离体细胞的研究，获取的研究结果与细胞生物学具有三个学科相似的信息。

细胞生理学：

研究细胞生命活动规律，如何从环境中摄取营养，经过代谢获得能量，以促进生长、分裂及其表达功能的。

分子细胞学：

从遗传信息 (DNA—RNA—蛋白) 角度研究胞内遗传物质的结构和表达的调控。

细胞社会学：

研究整体和细胞群中细胞间的社会行为，包括识别、胞通讯和相互作用，研究整体和细胞群对细胞生长、分化和死亡等活动的调节控制。

培养细胞学与细胞培养技术方向是:

揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老、防治疾病的手段或途径，人为地诱导细胞遗传性状的改变，使其向更有利于人类和自然界的方向发展。

细胞生物学和分子生物学的相互渗透，分子克隆技术与细胞培养技术结合:

阐明基因的结构与功能

阐明基因在细胞生长和分化中的作用

阐明细胞癌变机制.

活细胞的研究：是当前生命科学研究中的重要核心问题之一。

培养细胞学的应用

（一）病毒学

培养细胞为病毒的增殖提供了场所。

细胞是分离病毒最好和最方便的基质，体外培养的细胞存在以下特点：

无抗体；不受到非特异拮抗物质的影响；对病毒的敏感性比体内细胞为高。

利用细胞培养进行病毒定性和定量，测定50％组织培养感染量(50％tissue culture infectious dose，FCID5o)；

用于病毒感染及防治方面的研究：在制备减毒活疫苗和诊断用抗原时，细胞是病毒增殖的场所。

科学家指出：细胞培养技术是伴随着病毒学的发展而发展起来的。

采用离心感染法或提取病毒核酸进行感染，细胞打孔器协助感染可扩大病毒感染的宿主范围；

病毒感染指标易观察，光镜下可见细胞病变效应(cytopathic effect，cPE)、包涵体、细胞融合、血细胞吸附等现象，同时也便于用分子病毒学技术进行检测。

（二）细胞生物学

单个细胞克隆便于对细胞生物学的基础理论进行研究，如形态、结构、细胞器及其功能、遗传物质、核型、变异、细胞转化、生长周期等。

离体培养细胞便于进行环境因素、药物等单因素及多因素影响的研究，探索作用机制。

当今细胞生物学研究的热点

通讯和信号转导、增殖与细胞周期的调控、生长和分化、衰老和死亡以及干细胞的应用研究和细胞工程是以培养细胞学为基础，以细胞培养技术为手段和工具。

（三）细胞工程学

利用细胞融合及杂交技术，进行细胞工程的研究与开发。如生物反应器的开发研究，将编码某生物活性物质的基因导入动物受精卵，从这种受精卵发育的动物组织、体液分泌物中获得外源基因的表达产物。

（四）干细胞的培养

机体最原始细胞，具有较强的再生能力，在一定条件下可分化、增殖出各类细胞。

干细胞的数量极少，故需分离、保存并在体外大量培养，长成各种组织和器官。主要集中在造血干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞上，已成为干细胞研究的首要课题。

(五）淋巴细胞培养技术的应用

在培养环境中，淋巴细胞受某些生长因子的刺激，出现旺盛的分裂、增殖。淋巴细胞培养的成功对反映机体免疫功能状况起很大作用，如研究细胞标记，检测T、B细胞数量及功能，检测T细胞亚群(CD3、CD8、CD4．等细胞)的变化。

（六）遗传性疾病的产前检查

羊膜穿刺术获得羊水中的胎儿细胞进行培养，在妊娠早期诊断胎儿是否患有先天性遗传病。

少量胎儿脱落细胞是能分裂的，经2—4周生长，形成显著单层上皮样细胞，可按常规制备染色体。

检测甲胎蛋白(alpha—fetoprotein，AFP)等，产前检测出几十种代谢病与遗传病，较准确地指导优生优育。

（七）毒性实验及生物实验的工具

培养细胞学对化学物质、放射线、激素、药物等提供了最简易而又可靠的方法，并对毒性机制研究提供了良好的实验对象。对肿瘤细胞进行抗癌药物的药敏测试，以指导临床抗癌药物的使用及配伍。

（八）在现代生物技术中应用

基因分离、基因测序与表达、基因转移与重组、癌基因研究等。

第二节 体外培养 vitro  cultural

一、培养分类

组织培养 tissue culture

从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能的方法。

常用上皮组织:胚胎发育的内、中、外三个胚层均可分化成上皮组织。细胞形态较为规则，细胞间常以黏着物和特殊连接牢固相连。

身体不同部位的上皮组织，所处的位置有着不同的功能，主要表现为保护、吸收、排泄和分泌等功能。

分为被覆上皮、腺上皮、感觉上皮、生殖上皮和肌上皮等。

上皮细胞浓度：（1～3）x105/ml

成纤维细胞浓度：（2～6）x105/ml

细胞培养 cell culture

培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。

器官培养 organ culture

器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法。

二、细胞的特性

根据是否附于支持物上生长的特性分为: 贴附型和悬浮型

（一）贴附型    细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。

贴附型细胞的分型

1.成纤维型细胞：(fibroblast)   来自中胚层

特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。

起源：细胞来自中胚层间充质组织。

除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞血管内皮细胞。

注意：细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称,与体内细胞不同。

2.上皮型细胞(epithlium cell type) 来自外胚层 

特点：扁平不规则多角型、圆形核、细胞紧密相连成细胞增殖数目增多时,整个上皮膜随之移动。边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“ 拉网”现象与起源内外胚层组织有关。

组织: 皮肤表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。

3. 游走型细胞(wandering cell type)

特点：在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则, 密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞 区别。

4. 多形型细胞 (polymorphic cell type)

特点： 无规律的形态，如神经细胞。

（二）悬浮型细胞(suspended cell type)

特点： 不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间的生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。S180肉瘤、K562、 HL－60和白细胞。

分型的目的：

方便描述细胞在培养过程中的形态变化。培养条件好时，细胞相对稳定，可反映出起源、正常异常的区别，作为判定细胞生物学性状指标。

但一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。如：反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。细胞在接种时呈三角型状态，经培养一定时间后，细胞在传代前已形成上皮型细胞。

三. 细胞生长与增殖 

培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器，生存空间及营养有限，当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为“传代”(passage或subculture)。

值得注意的是：每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响。

（一）细胞生命期(life span of culture cells)

指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。

例如：二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生命，细胞便开始凋亡(apoptosis)。

细胞在生存过程中经历以下三个阶段

1.原代培养期(primary culture)

组织到第一次传代 时间大约为1～4周

特点：细胞活跃移动,分裂,但不旺盛多呈二倍体核型。

原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。

各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明细胞独立生存性差。

2.传代期(passage)

初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)

特点：细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploid cell line)为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。

一般细胞在10代以内冻存。

冻存配方：

向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

存于在液氮中温度可达到－196℃，可长期储存。如解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞性状不受影响，成为保存细胞最主要的手段。

3.衰退期

特点：细胞仍生存—增殖减慢—不增殖—轮廓增强—衰退凋亡

注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期）在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneous transformation);

细胞可能获得永生性(immortality) 或称为恶性 (malignancy)。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系(continuous cell line)。当细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。

（二）培养细胞一代生存期

“ 一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段：

贴附现象是复杂和受多种因素的影响。

细胞不贴附：底物表面不干净，影响细胞贴附。

利于细胞贴附：底物表面带有阳性物质与特殊物质:  纤粘连蛋白(fibronectin FN)、细胞表面蛋白(cell surface protein CSP)

这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。

1.潜伏期(latent phase) ： 

接种 经过悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形)贴壁。

初代培养细胞经过 10～24小时或更多时间。

连续细胞系和癌细胞系经过10～30分钟贴附。

潜伏期特点：

长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。

(1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见分裂相，细胞有运动活动。

(2)初代培养 细胞潜伏期约为24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6～24小时。

(3)细胞接种密度大潜伏期短。

(4)细胞出现分裂相增多时，标志细胞进入指数增生期。

2.指数增生期(logarithmic growth phase)：

特点：细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多，细胞分裂指数(mitotie index MI) ：表示每1000个细胞中的分裂相数。

条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。

细胞分裂指数：

初代细胞：在0.1％～0.5％之间％ ,

连续分裂细胞和肿瘤细胞：3 ～5％。

指数增生期是作为细胞一代活力最好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。

指数增生期持续3～5天，细胞数量增多后生长空间变小，细胞相互接触可连接成片。

正常细胞：细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。

肿瘤细胞：没有这种现象，可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使细胞发生堆积(piled up)。

由于细胞不断增殖分裂，细胞数量持续增多，培养液的营养成分减少，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞分裂停止。

3.停滞期(stagnate phase)

细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平，也称为平顶期(plateau）。

特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。

注意：传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传  1～2代  。

通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。在这一点上操作时一定要特别注意。

四.培养细胞的增殖过程

G1期特点：

细胞进入增殖状态。细胞持续时间的长短取决与营养物质的获得和生长因子的作用短则4～6小时，长可达几天；此期细胞内蛋白质合成、RNA合成、核糖核蛋白体合成增多，胞体增大，是镜下唯一可见的变化。

G1期的细胞是接收外界因子影响的特定阶段称为调节点(reguluation point RP)如细胞获取营养不足或因子的缺乏在R点作用下,细胞在G1期发生受阻, G1期时间延长。

S期特点：

细胞发生DNA合成，约为6～8小时，DNA合成一经开始，能持续进行，独立性较大，并对环境不利因素有一定耐受能力。由于DNA在进行合成时，多核苷酸双链发生分离，细胞易受到突变或致癌因素作用的影响。

值得注意：

S期是遗传物质易受突变物损伤的时期。

G2期特点：

DNA含量加倍，具有4倍量的DNA。细胞持续时间较短平均为2～5小时。

细胞发生与细胞分裂有关的RNA合成和染色质螺旋化。

细胞对外界环境敏感，易受温度、pH及各种其他因素的影响而受阻，不能进入M期。当不利因素消除后,细胞能很快恢复。

M期特点：是研究细胞有丝分裂过程理想的对象，细胞分裂相形态和分裂过程，在相差显微镜下可清晰观察到。

细胞分裂过程分期：  

前期：细胞质逐渐回缩，细胞体变园与底面附着面减少，脱落入培养液中，染色体由分散状态开始向细胞中央部移动，突然“  冻结”于赤道平面，前期持续时间为20～30分钟。

中期：正在发生的变化：复制后的染色体任意地排在纺锤体的中央(称赤道板)。

后期：染色体分成两组分别向两极移动,整个细胞由圆球形  变成  椭圆形,胞体呈哑铃形,后期时两组染色体相互分离。

细胞分裂过程最快持续时间5～7分钟，在镜下可直接观察到。

末期：两组染色体达到两极,胞体中部变细染色体变成染色质,核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞,有细丝相连,经过较长时间两个子细胞各自独立。

细胞质延展于底物变扁。

末期持续时间为20～30分钟。

细胞分裂全程持续时间一般为30～60分钟。

因细胞种类不同和温度变动,分裂时间将有一定差别。

五.细胞和细胞、细胞和基质的相互关系

一定条件下：单个细胞表现独立性，生存和增殖,但不能长久生存。有活力的细胞需要繁殖形成群体细胞，是培养细胞的基本存在形式。与体内细胞相似,细胞与细胞之间具有形态和机能上相互依存关系。

结构:上皮细胞可见桥粒,说明细胞间有扩散的能力。

生理活动四个要点:

单个细胞生存能力不如群体细胞强,说明细胞之间能相互沟通信息。

正常细胞一旦两相邻细胞发生接触，出现接触抑制现象,导致运动停止。

正常细胞群体依赖性（population dependence PD）比恶性细胞PD小。

单细胞培养和软琼脂培养是检测细胞PD的常用方法。

体内细胞：细胞的分化与细胞外基质(extracellular matrix ECM)有密切关系。

离体培养细胞：细胞对ECM也仍有依存性。应用适应的ECM（如上皮细胞对胶原）能诱导细胞特性表达；ECM对细胞贴附、分化、生长和增殖等都起到重要作用。

小结--细胞生存状态

体外培养的细胞与体内细胞相同,体外细胞具有两种生存状态:

增殖态: 通过分裂增殖,细胞数量增加;

分化态:向特定方向分化,完成细胞特定功能活动,如保护、分泌、吸收和排泄等。

细胞两种功能状态是相对的，交替发生并相互依存。

六.细胞生存环境、条件和代谢

培养细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。

（一）环境

培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。                

(二)温度：

人哺乳动物：36.5℃±0.5℃;

鸟类：38.5℃;

培养细胞对低温耐受力比高温强；温度上升不超过39℃时,细胞代谢强度与温度成正比。

39～40℃1小时,受损伤的细胞可能恢复；

41～42℃1小时,严重损伤,个别细胞恢复；

43℃以上1小时，细胞全部死亡

温度不低于0℃时,细胞代谢有影响,无伤害作用;

置于 25～35℃，细胞能生存，但生长速度减慢；

放在 4℃  数小时,再放回 37℃ 细胞仍继续生长。

细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时,细胞因胞质结冰受损而死亡。

(三)气体环境和氢离子浓度

气体：氧气和二氧化碳

氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。

开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。

CO2：细胞代谢产物, 是细胞所需成分。

主要作用:维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。

有些细胞存在差异。如羊水细胞培养检测染色体时pH为7.6。

细胞耐酸比耐碱性大一些,在偏酸性环境中更有利于细胞生长。

为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸缓冲剂方法。

磷酸缓冲剂中NaHco3,可供给CO2但容易逸出，适用：封闭式培养的细胞。（无CO2培养箱）

Hanks平衡液：含有低浓度的NaHCO3,当打开含有Hank液培养瓶时，CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液pH变碱，细胞在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒。

羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-Hydroxyethyl Piperazine-N`-Ethanesulfonic Acid缩写HEPES)

HEPES：对细胞无毒性也不起缓冲作用，主要作用是：防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持恒定的pH。

（四）细胞生存所需基本物质

与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。

糖：六碳糖是主要的能源通过糖酵解 形成 乳酸和通过柠檬酸形成  CO2。

胚胎细胞和一些转化细胞的培养基中常见到乳酸堆积现象。

糖是合成某些氨基酸的原料；

经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪；

经过糖解磷酸通路能合成核酸。

各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力,其中葡萄糖最强,半乳糖最低。

2. 氨基酸：

12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。

所有细胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促进各种氨基酸进入细胞膜。

所含的 氨  是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；

是合成3，2和一磷酸腺苷时所需物;

是能源和碳的来源。

如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死亡。所以要求各种培养液中都含有较大量的谷胺酰胺。

谷胺酰胺在溶液中不稳定，应放置在－20℃冰箱保存，用前加入培养液内。已含有谷胺酰胺的培养液在4℃冰箱内可放置两周以上时重新加入原来量的谷胺酰胺。

需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。这些维生素在常用培养基中已成为固定组成分。

脂溶性维生素对细胞生长也有作用,一般从血清中得到补充。

3.促生长因子：

培养液除营养成分外，也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。

胰岛素(1-10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基酸；

氢化可的松(10-8 - 10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率；

雌激素和雄激素，或使用黄体酮和氢化可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。

血清是提供生长因子和其细胞所需物质的来源。目前血清、各种组织和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。

4. 其它物质：

在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰、钼钒等。

需要促细胞粘附物质其作用是：有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上组织生长。

5.人工培养基：

细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供给细胞营养和保证细胞生长组织的物质。

培养基种类:半固体和液体培养基两类。

液体培养基：分为合成、天然和无血清培养基三种。

A．合成培养基：

成分清楚,通过调节各种成分的数量和种类,再借观察细胞生物状况反应性变化,测定细胞与外界环境的适应能力。借以了解细胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。

合成培养基在应用上广泛。

B．天然培养基：

用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。

加入5％血清：维持细胞不死或缓慢生长；

加入10％～20％血清：细胞增殖生长。

血清的主要作用

提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。

补充培养液中没有或量不足的营养成分。

含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。

提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。

有中和毒性物质保护细胞不受伤害。

提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。

血清存在的问题

存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。

成分不明确，影响对结果的分析。

不同动物、不同批次的血清和活性差别较大，使培养的结果不稳定。

C.无血清培养基(serum free medium SFM)：

条件培养液其成分已知； 排除含血清培养基的未知成分的干扰，实验结果可靠。

主要应用：蛋白质组和生物工程的研究。

在无血清培养基中，可以加入其他来源的蛋白质，如：白蛋白、牛脑垂体提取物、植物提取液。具有促进细胞生长增殖的作用。

6.附着底物:

除少数悬浮型细胞外,绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上生长。不同细胞对底物要求不同，底物不适对细胞生长不良。

常用的底物：

A.玻璃：如用NaOH处理，性质能受到一定影响;酸中和以后再用（新的盐酸泡）易碎。

B.一次性塑料：

聚苯乙烯: 多为一次使用。

聚四氟乙烯包括：

充电荷：亲水性，适用单层培养

不充电荷：疏水性，适用巨噬细胞、转化细胞的培养。

聚四氟乙烯透气性好可制成薄膜，剪成小块后放入各种瓶皿中，适于细胞贴附生长，也便于取出，可进行染色和做电镜切片。

7.抑制细胞生长因素

（1）培养液消毒

（2）操作不慎使有毒物质混在细胞生存的环境中，抑制细胞生长。

（3）血清灭活处理可除去补体和降低免疫球蛋白的毒性,并不损伤多肽生长因子，但可能消灭另一些更有用的营养成分，因此有人提出，灭活血清不一定比不灭活血清更好。

第三节 培养细胞的分类

正常细胞培养

人或动物体外培养都不易，建立细胞系更难。

原因：是分化细胞；生存条件严格；目前没有模拟与体内完全一样的方法；只要一切条件适当时,仍有培养成功的可能；初代比传代容易。

体外培养的上皮组织基本特点

来源：外、内、中三个胚层。

特征：

1.细胞排列密集，易形成膜状呈贴壁性生长。细胞常相互粘附，具有生长的接触性抑制现象。

2.上皮组织细胞的结构和功能同样表现出极性。

3.细胞的增殖和分化依赖于促细胞生长因子的作用。

4.上皮细胞的特殊结构，如微绒毛、紧密连接、桥粒等，在培养细胞中也可见到。 

细胞极性（Cell polarity）:

A.是指细胞在形态和功能上的方向性和不对称

B.形成的中枢位于中心体。中心体是细胞的中心。间期细胞的中心体只有一个，从中放射出微管系统。中心体只能位于细胞核的一侧，这便有了“上下” 之分。

C.细胞内许多细胞器的定位、物质的运输和分拣等，均与微管运输的向着正极或向着负极方向有关。

定向转运体系:

该体系能够确保哪些物质被运送到上皮细胞的质膜顶区，哪些被运送到细胞的侧面或底面。

例如，从内质网到高尔基体再到胞内体和分泌囊泡的定向转运体系就是通过与微管系统的偶联实现其方向性的。

细胞表面:由细胞表面提供的方向信息也可以通过信号转导和细胞骨架系统传递到细胞内部。

细胞皮质:细胞皮质可以选择性地吸附不同种类的mRNA，使细胞内形成蛋白质合成的浓度梯度，从而提供极性参照物质。

上皮组织的细胞培养条件要求比较高，常需生长在特殊的生长基质，极易失去在体内巳有的分化特征，如细胞极性等。

注意：

保证上皮细胞在体外的生长和繁殖；

应尽可能地恢复和诱导上皮细胞在体外培养状态下的分化。

这是上皮组织体外培养成功与否的关键。

上皮细胞体外培养的特殊条件

(1)防范微生物污染：

根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。

要求在组织取材时就严格灭菌；

分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。

培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。

(2)生长基质的支持：

上皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。

在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。

(3)特殊的培养基：

培养基有M199、RPMl 1640、DMEM和HamFl2。

其中以M199和RPMl 1640较为常用。

M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。

DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。

可促进上皮细胞的贴附；

维持上皮细胞在体外培养状态的分化。

HamFl2培养基的特殊性

特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。

在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。

加入血清，但出厂血清成分复杂，含有一定量的有毒物和抑制物。

(4)去除成纤维细胞：

上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。

取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。

因在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。

内皮细胞：

来源：人脐带脐静脉，动物动脉

消化：用胶原酶比胰蛋白酶消化好。

但要注意掌握消化时间和杂细胞（成纤维细胞和平滑肌细胞）。

内皮细胞的鉴定

用免疫组化染色检测VIII因子相关抗原和CD34抗原, 鉴定内皮细胞。

观察细胞是否呈单层贴壁生长, 细胞形态，如长梭形、多角形三角形、四边形为主, 呈典型的“铺路石”样征象 ；

观察第三代细胞纯度是否达95%以上。

如消化时间过长或操作不慎、刮取过重时，会造成血管内皮下层与外膜成纤维细胞以及中膜平滑肌细胞污染。由于这些杂细胞生长较快，随着传代次数越多，其污染的程度越重，从而使培养失败。

介绍排除杂细胞的方法：

1、使用含肝素的培养液：

在培养液中加入90 U／ml的肝素，可使内皮细胞纯度提高；

2、在相差显微镜下刮去明显的杂细胞群。

表皮细胞:

来源：小儿包皮、全皮细胞不易与成纤维细胞混合生长区分。

以胶原为底物；

温度低易生长；

在培养基中加入氢化可的松(10g/ml）；或 10-6 异丙肾上腺素；或10-10霍乱毒素；或10ng/ml表皮生长因子；

上述任何一种物质细胞易生长。

巨噬细胞：

特点：保持原有形态和吞噬物功能，易于分离不易建立传代细胞系，生存2～3周

无刺激：小鼠/只  2 ～ 3106个/只

刺激物：牛血清、矿物油、硫羟乙酸盐，刺激1ml/只 20 ～30 106 个/只,但刺激物难消化掉，残留在细胞内，干扰细胞生长。

用40ugPHA注射腹腔中 6 ～ 18 106 个/只，效果好。

乳腺细胞：

来源：腺上皮细胞

消化：胶原酶

注意：接种底物加胶原

使用1640培养基加10％小牛血清,补加氢化可的松、胰岛素；乳腺细胞易生长。

心肌细胞：

来源：心室肌,1～3ｄ龄, 剪成0 .5～1ｍｍ3大小组织块,放入锥形瓶中。消化：加入 (0. 8ｇ/Ｌ)胶原酶Ⅰ,在37℃水浴,磁力搅拌器转速为100ｒ/ｍｉｎ,消化10分钟。

消化:胶原酶Ⅰ, 0.25%胰蛋白酶

易于生长：50ｍｇ/Ｌ多聚赖氨酸涂在培养瓶内.

注意：分次消化可减轻胶原酶或胰蛋白酶对单细胞的破坏作用。消化温度在35～37℃左右,过高温度会增加胶原酶或胰蛋白酶的毒性,温度过低会降低胶原酶或胰蛋白酶的活性。

心肌细胞质量评价：

纯度鉴定:镜下观察、计数纯化后的细胞；

观察：心肌细胞成圆型    成纤维细胞成梭形,

计算：心肌细胞纯度=心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)×100%。

神经细胞：

消化：0.1%胰蛋白酶 

10－5 M 阿糖胞苷去除胶质细胞。

成纤维细胞

建立细胞株系的最常用

来源：以人胚皮肤、幼儿包皮为好

消化：胰蛋白酶

注意：

1.从细胞生长到第一次传代需1～2个月左右时间

2.以后传代7～10天传1次，3～4天/次（换液〕

3.无菌操作减少霉菌的污染;二性霉素抑制霉菌生长，但也能抑制细胞生长

4.如组织块，绝对避免翻动和振动，否则组织块不易附着或附着后脱落.

干细胞的培养

干细胞(stem cells)是指来自胚胎、胎儿或成体未分化的具有无限或长期自我维持和自我更新能力的细胞。

两个基本性质：即能够自我更新和能产生许多分化的后裔。

根据组织来源不同，干细胞分为：

1、胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)

2、成体干细胞(adult stem cell，AS)。

细胞在体外特定的培养条件下，能连续传代，分化为外胚层、中胚层和内胚层多种谱系细胞，保持了正常细胞的核型和极高的端粒酶活性。

胚胎干细胞的培养 ：

1、胚胎干细胞（ES）来自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的内细胞团(inner cell mass，ICM)。

2、胚胎生殖干细胞(embryonic germ cell，EG； germ stem cell,GSC)，是负责产生配子的一群具有自我复制能力的细胞。与ES相似，具有发育、分化的潜能和特征，但组织来源不同于ES。

成体干细胞的培养

成体干细胞(adult stem cell，As)，是一种存在于不同组织中的未分化的细胞，并长期保持自我更新的能力，具有分化为该组织特定形态特征和功能的各种类型细胞。

成体干细胞具有可塑性，在特定培养条件下可从一种组织类型分化为另一种组织类型，如造血干细胞能分化为神经干细胞，尽管其机制不明，但提示特定的培养细胞生长的微环境(niche)对细胞的分化起着至关重要的作用。

人成体肝脏干细胞体外分离、培养及鉴定

肝癌旁组织剪小, 4 ℃Hank’s 液反复冲洗。离心, 加入0.05%Ⅳ型胶原酶溶液, 37 ℃恒温水浴振荡消化(1h),过200目网滤, 离心。用4 ℃无血清DMEM/ F12 培养液漂洗细胞沉淀, 离心 。

细胞在含15%胎牛血清DMEM/F12培养液,接种于一次性塑料培养瓶中, 可加入25μg ·L- 1生长因子浓度,放入培养箱培养2周以上。

以细胞长满瓶底为准.

生长因子作用:

肝细胞生长因子( HGF) 、

α-成纤维细胞生长因子( FGF) 、

表皮生长因子( EGF) 及白血病抑制因子(LIF)

对肝癌癌旁组织细胞的原代培养非常重要, 可获得比较稳定的细胞以便传代。

人成体肝脏干细胞鉴定

免疫磁珠筛选

加抗人C2-kit抗体,4℃,30 min。加免疫磁珠20μL, 4℃放置15 min 。加Buffer.

安装免疫磁株架, 向磁柱中加入Buffer 500 μL , 清洗磁柱。将细胞混匀加入磁柱中, 磁柱中液体滴入底面放置的无菌试管中;

所滴出的细胞为C2kit-, 留在磁柱上的为C2kit+。取下磁柱, 将磁柱中的细胞液(C2kit + ) 压入试管中,离心, 加入到培养瓶中, 放入培养箱中培养。

C2kit + 细胞免疫荧光染色:　将多聚赖氨酸包被无菌盖玻片置于24 孔板内, 细胞爬片, PBS冲洗, 固定。

第一抗体:加入1:50 兔抗人特异性一抗AFP及1:50 鼠抗人特异性一抗CK19,过夜。

第二抗体:  PBS 液漂洗。滴加荧光二抗: 1:50FITC 标记羊抗鼠IgG 及1∶100CY3 标记羊抗兔IgG, 37 ℃孵育30 min. 漂洗后, 荧光显微镜下观察。

CY3 标记的AFP 呈红色颗粒 。

FITC 标记的CK19 呈绿色颗粒。

二者均在胞质内表达。CK19 及AFP 在胞质内有部分重叠, 呈黄色荧光。

肝细胞的标志物:AFP、白蛋白,

表达胆管上皮的标志物如角蛋白CK7 、CK19 等,

白血病抑制因子(LIF) 抑制细胞分化的目的。

二、肿瘤细胞培养

特性：

1.与非肿瘤细胞相比能在某些环境内优势生长。

2.形成有缺陷的多细胞结构。

3.体内的肿瘤与体外培养的肿瘤差异小。

4.具有自我保持“ 干细胞”繁殖无限的代数。

5.肿瘤部位含有非癌细胞即：间质细胞、被肿瘤侵入的正常组织的残余细胞。

1.特点：

光镜：细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。

EM：微绒毛、细密，微丝走形不规则。

增殖：癌细胞在低血清中(2%~5%)仍能生长  表明有自泌或内泌性产生 促增殖因子的能力, 形成集落克隆能力,增殖数量,细胞重叠形成堆积物。

浸润性：是肿瘤细胞扩张性增殖行为,与正常组织混合培养时能浸润入其它组织细胞中。

异质性：  同一肿瘤内细胞的活力有差别。  

周边细胞：血液供应增殖干细胞(stem cells)是支持肿瘤生长的成分易于繁殖。

中心处细胞：细胞衰老退化，有的处于停滞期。

遗传性： 失去二倍体核型，呈异倍体或多倍体。

2、肿瘤细胞在体外不易生长原因

(1)依赖性：虽有较强克隆生长能力，仍有一定的群体性或与其细胞相依存关系。

(2)分散培养细胞量影响细胞增殖的活性。

(3)肿瘤干细胞数量

(4)有些肿瘤细胞可能需要与体内相似的特殊生存条件。

3、如何培养好肿瘤细胞

取材、成纤维细胞排除，培养液和培养底物。

(1)取材：尽量避免取退变组织，癌性转移淋巴结、胸腹水是好的培养材料，组织尽快培养，如不能立即培养，可贮存于4℃，不宜超过24小时。

(2)培养基的选择：

RPMI1640、DMEM、mc-coy5A

有些肿瘤细胞需要生长因子，如乳腺癌细胞。

注意：含有血清和相关生长因子更易培养成功。

(3)成纤维细胞的排除

成纤维细胞>肿瘤细胞的生长。

机械刮除法：

标记肿瘤细胞生长的范围（画圈），刮除直至完全刮除掉为止  。

反复贴壁法：

不加血清培养液，把含有两类细胞的悬液反复贴壁使两类细胞相互分离。

4、肿瘤细胞初代接种可能出现几种现象

完全没有细胞移动;

有细胞移动,但无增殖,长时间处于停滞状态,

有增殖，传代后停止生长或衰退死亡;

传了几代后细胞缓慢增殖经过一段停滞,又旺盛生长，形成稳定生长的肿瘤细胞传代系;

说明：肿瘤细胞对体外生存条件要求高,不能局限一般培养法可采用一些特殊的措施。

选择适应底物：纯化细胞接种不同底物,如鼠尾胶底层，饲细胞层。

生长因子：加一种或几种促细胞生长因子或促生长物、胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。

动物体媒介培养：癌瘤嫁动物体内取出培养裸鼠最好，瘤块长大再培养。                     

第四节   培养细胞成功与失败综合分析

一、材料选择：

细胞供给年龄：幼年>老年容易培养

同一个体细胞：分化低>分化高

同一个培养物细胞成分不一,存在异质性,分化程度,生物性状增殖能力,对体外培养适应性不同。

如皮肤成纤维细胞大多先生长,干细胞比非干细胞易生长增殖。

二、培养条件：

细胞对培养基需求不同,没有一种培养基是万能的。应选相适应的培养基。

注意：要想培养稳定的细胞,应了解细胞生物学性状和特殊需要。

三、选择不同贴附的底物

四、消化酶选择

胶原纤维多的组织：胶原酶消化

上皮组织细胞： 胰蛋白酶

五、培养过程污染与排除

1、污染

空气：操作净化工作台,工作不带口罩,外界气流过强,温度大,含菌

消毒：残留污物 

操作：马虎不准确，观念不强

血清：检测不严，支原体和病毒 

组织：原代组织有污染，手术中污染，本身是污染组织（溃烂的肿瘤，碘酒消毒后，擦试不净。可能混入污染）

2、污染对细胞的影响

污染时间短、轻，及时排除，细胞可能恢复。

轻：细胞生长缓慢、分裂相，细胞变粗糙，细胞轮 廓增强。

重：停止增殖,分裂相消失,胞质中出现大量堆积物， 细胞变圆,崩溃并从瓶壁脱落 。

3、微生物：

支原体：无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞影响潜在。

霉菌：

细菌：增殖快，短时间在数量上压过细胞产生毒素杀死细胞。

病毒：

真菌：种类繁多，形态各异，呈白色或浅黄色小点，飘浮于培养液面，肉眼可见。

镜下：呈丝状或管状、树枝状丝，纵横交错穿行于细胞间。

支原体：介于细菌与病毒之间，能独立生活的最小微生物无细胞壁，形态多样，0.2um，可通过滤器圆形丝状或梨形，在光镜下很难看清结构。对青霉素普遍有抗药性。

细胞受到支原体污染后出现以下情况：

严重：细胞增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。

轻：无明显变化，或有微细变化由于传代和换液而缓解观察不够细心或缺乏经验，检查不出。

支原体检测：

相差：油浸下观察，暗色微小颗粒，有类似布朗运动，分布细胞表面和细胞之间。

值注：支原体与线粒体相似，需加以区别支原体染色Carnoy固定。

低张处理地依红：地依红2g冰醋酸60ml加水至100ml染色15分钟脱水封固。

光镜:支原体为暗紫色小体,附细胞外或散在细胞之间。

Hoechst33258:为DNA特异结合的荧光探针，支原体DNA能被着色，是检测支原体最方便、有效的一种方法。

醋酸:甲醇（1:3）固定，33258(50g/ml)染色10分钟，漂洗后观察。

工具：微孔滤膜：  能滤除支原体在内的粒子，处理受支原体污染的培养液或血清，但不能去掉附于细胞表面的支原体。

药物：溴尿嘧啶(Bromouracil)支原体的DNA也摄取溴尿嘧啶，用光照射，通过光敏效应杀灭支原体。

第五节 细胞观察

活细胞观察活性染料固定染色法

一.活细胞观察

镜下观察：

细胞无色透明，倒置显微镜或相差显微镜观察细胞形态结构：细胞膜和细胞质。

生长状态好:胞内无颗粒,不见空气,胞膜清晰,上清液透明，无悬浮细胞和碎片。

生长状态不好：胞质出现空气脂滴和颗粒状物，细胞之间的空隙加大细胞形态不规则。

1.活性染料：

原理：能进入活细胞,一些无毒或毒性很小的染料,电性吸引而堆积在细胞中某些特定的结构从而显色,不引起物理和化学变化,对细胞生命活动不会产生影响或影响很少。

包括：中性红、结晶紫、健那绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫。

特点：它们解离后带正电荷，属碱性染料与胞内构造有一些结合。

二．固定染色方法

1．固定：迅速杀死细胞再染色进行观察。

目的：使细胞内的蛋白质、脂肪、核酸及糖等转变为不溶性物质，避免自溶腐败。固定的细胞保持原有结构，保存时间长。 

由于固定剂性能不同，如一种固定剂对某种结构保存效果好，但对别的结构就不一定适合，染色剂对细胞内的各种化学成分有不同的亲和力，所以每种组织通常有一些特定的固定染色方法。

一.常用固定剂包括:

1.75％酒精、

2.4％多聚甲醛（多聚甲醛为粉末状，缓慢加入在60℃水浴中溶化），

3.甲醛/冰醋酸（冰醋酸1份：甲醛3份），

4.FAA（80％乙醇90ml、冰醋酸5ml、中性福尔马林5ml）

5.中性福尔马林：福尔马林10ml、Na2HPO4(无水)0.78g、NaH2PO4(无水)0.42g加0.85%NaCl至100ml。

6.Carnory固定液：纯酒60ml、氯仿30ml、冰醋酸10ml。

二. 染色方法：

使死细胞着色的大多数是酸性染料，它们不易穿透活细胞的质膜，进入胞内，却能渗进死亡的细胞，使死细胞着色。

（1）台盘蓝(trypan bule)

0.4%～1%溶于生理盐水，pH7.0～7.2，取0.1ml/ml细胞悬液染色2分钟后镜下观察死细胞为蓝色。此染色时间不易过长，有毒性，如染15分钟以上，活细胞会受到损伤而着色。另外，台盘蓝不宜久存时间长了有毒性。（蓝色）

（2）苯胺黑 (Amiline black)

0.05%苯胺黑Hanks溶液以1：10量细胞悬液混合1～2分钟后，镜下观察：死细胞着黑色，苯胺黑染料毒性很小。

（3）赤藓红B(Erythrosin B)

PBS或Hanks溶液洗去血清取细胞与0.02%赤藓红B混合，两小时之内镜检:死细胞着红色。

（4）伊红Y(Eosin Y)

细胞悬液与7倍量的0.15%伊红Y染液（生理盐水配制）混合2分钟后镜检，死细胞为桃红色。

第六节 培养细胞学的常用术语

1．培养细胞学(cultural cytology)  应用细胞培养技术研究离体细胞的生命现象和规律，从细胞水平上了解与掌握机体生、老、病、死规律的一门科学，是细胞生物学的一个分支学科。

2．体外培养(in vitro)  原意为在体外或在试管内培养，现常与组织培养一词通用，译为体外培养。

3．组织培养(tissue culture)维持组织在体外生长，也称为体外培养

4．器官培养(organ culture)维持器官、器官的部分或器官的原基在体外生存的方法。

5．细胞培养 (cell culture)细胞(包括单个细胞)在体外条件下生长称为细胞培养，细胞不再形成组织。

6．细胞融合(cell fusion)体外培养条件下，经化学剂(如聚乙二醇)、病毒(如仙台病毒)或物理方法(如电脉冲) 诱发，使不同种的体细胞融合产生杂交细胞(hybrid)。

7．细胞杂交(cell hybridization)  2个或多个不同的细胞融合，导致一个多核细胞(muhikaryon)的形成。

8．细胞系 (cell line)  原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。由原细胞系分离出具有与原细胞系不同性状的细胞系称为亚系(sub—line)。

9．细胞株(cell strain)  通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物为细胞株。由原细胞株分离出具有与原株性状不同的细胞株称为亚株(sub－strain)。

10．细胞周期(cell cycle)

11．休止(quiescent)

12．细胞一代时间(cell generation time)  单个细胞两次连续分裂的时间间隔。

13．代或世代(generation)从细胞接种到下一次传代再培养的一段时问叫一代。培养一代，作为单个细胞可倍增3～6次，作为群体细胞要经游离期、对数期与停止期等三个阶段。

14．群体倍增时间(population doubling。time)  在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间。

15．原代培养 (primary culture)

16．传代(passage)

17．单层培养(monolayer culture)  

18．贴壁依赖性(anchorage—dependent)  细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质为贴壁依赖性。贴附于不起化学作用(如玻璃或塑料等无活性)的物体表面而繁衍出来形成单层的细胞称贴壁依赖性细胞(anchorage dependent cell)。

19．汇合(confluence)  在器皿中培养的细胞相互连接，彼此汇合形成单层。

20．接触抑制(contact inhibition)  贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S期，也不会出现交叉重叠生长。

21．悬浮培养(suspension culture)

22．密度抑制(density inhibition) 

悬浮培养细胞的数量达到一定密度后引起抑制增殖的现象。

23．群体密度(population density) 

培养器皿内每单位面积或体积内的细胞数，多用细胞数／平方厘米(cm)表示。

24．饱和密度(saturation density)

在特殊培养条件下，每平方厘米(单层细胞培养)或每毫升细胞悬液中可达到的最大细胞数。当细胞达到饱和密度后，细胞群体停止繁殖。

25.体外转化(in vitro transformation)

细胞在体外培养过程中发生了与原代细胞性状不同的转化，并可遗传变异，但不具有致瘤性。

26.体外恶性转化(in vitro malignant transformation)  细胞在体外培养过程中获得了致瘤性转化，当把这种转化细胞接种于适当的动物后可产生肿瘤。

27.核型(karyotype)  一个细胞全部染色体的组成和特征。

28. 二倍体细胞系或株(diploid cell line or strain)  具有两套染色单体数目，即具有二倍体核型的细胞系或株。

29．有限细胞系或株(finite cell：line or strain)  细胞系或株形成后仅能维持有限传代次数，如一般二倍体细胞系仅能传50代左右，最后衰亡。

30．连续(或无限)细胞系或株(continuous or infinite cell line or strain)具有无限繁殖能力，即获得了不死性(immortality)，能反复进行传代的细胞系或株。