亲和免疫组织化学技术的基本原理

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一、卵蛋白和生物素免疫 染色
很早以前，人们就注意到给动物喂饲大量鸡蛋白时，可引起明显的“维生素H缺乏症”。经研究发现，在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白质，分子 量约为68，000，属于糖蛋白一类。当时命名为卵白素（Avidin）。卵白素具有4个由128个氨基酸组成的相同亚基，与生物素（又称维生素H）以及其他物质（例如荧光素和酶）具有很高的亲和力。当动物被饲以大量鸡蛋白时，由于卵白素将大量的维生素H结合所致动物出现维生素缺乏。卵白素在一般条件下性质稳定，可耐受80 oC两分钟而仍保持其活性，当与生物素结合形成复合物后，性质就更稳定，可在很大的PH范围内以及对许多蛋白酶都有耐受能力。
生物素（维生素H，Biotin）是Kögl等（1936）首先从鸡蛋黄中分离出来的。它还广泛地分布于动、植物组织中，并以辅酶的形式参与各种羟化酶反应。生物素为一种较小分子量的维生素，其分子量约为244，它与卵白素之间具有高度极强的亲和力，较之抗原 与抗体的亲和力高出100万倍，能够彼此牢固地结合而不影响彼此的生物学活性。
由于卵白素和亲和素之间具有高度的亲和性，生物素可与抗体偶联，不论生物素还是卵白素均能与酶（过氧化物）结合并不影响酶的活性，这样就将亲和化学和免疫细胞化学结合起来而形成卵白素-生物素免疫染色技术。
卵白素和生物素用语免疫细胞化学标记技术只要有以下几种形式。
1.标记卵白素-生物素（Labeled avidinbiotin, LAB）技术，是将活化的生物素（即利用生物素的羧基加以化学修饰后的可制成各种基团的衍生物）和免疫球蛋白等共价偶联后，加入与荧光或过氧化物酶结合的卵白素，利用生物素和卵白素的亲和结合，显示生物素欧联的物质（即抗原）。
2．桥式卵白素---生物素（bridged avidin biotin BRAB）技术，是利用卵白素作为桥梁，连接生物素偶联物质和生物素化的过氧化酶，而显示于生物素偶联的物质。
上述两种方法均须以生物素标记第一抗体（即特异性抗体），应用有一定的困难和局限。
3.卵白素—生物素---过氧化物酶复合物（Avidin-biotin peroxidase complex, ABC）技术，该技术是由1981年Hsu等在LAB和BRAB的基础上，改良进行建立的。现将卵白素和生物素偶联的过氧化物酶按一定的比例组合成卵白素—生物素---过氧化物酶复合物，从而保证卵白素有一定的游离结合点让生物素偶联物质结合。由于一个卵白素分子具有可与生物素结合的4各位点，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶结合，另一部分具有可与生物素标记的免疫球蛋白反应，生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白可以结合多个生物素分子，从而增强了免疫球蛋白或过氧化物酶结合卵白素的能力，这样卵白素就可作为桥梁，把生物素抗体结合物及生物素酶结合物连接起来进有可能偶合更多的酶分子，并且这种相互作用的连接能形成一种较大的类似晶体的复合物，从而大大提高了酶染色的灵敏度。
因此，ABC技术具有以下优势：
（1） 敏感性强。Hsu等应用ABC法与PAP法相比发现其敏感性较PAP发高20—40倍，能显示PAP法所不能显示的抗原。
（2） 特异性强。由于敏感性提高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能高的浓度，减少了非特异性染色，背景淡。
（3） 方法简便。由于脸白素和生物素间的极高亲和能力，使得结合时间可明显缩短，符合物的制备是操作简便。
（4） 由于生物素和卵白素具有和多种示踪物高度亲和的能力，可用于双重或多重免疫染色。
二、葡萄球菌A蛋白免疫染色
葡萄球菌A蛋白（staaphylococal protein A,SPA）是一种从金黄色葡萄球菌壁上分离的蛋白质。早在1940年，Verwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散实验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1952）也发现了类似现象，并将其命名为A抗原。其后分离并证明了这种物质是一种蛋白质，为了与A多糖相区别，Crov（1960）将其命名为葡萄球菌A蛋白，简称SPA或蛋白A。由于SPA的一些免疫特性，引起了很多免疫学家的兴趣，并迅速发展成为免疫学上一种极为有用的工具。