免疫组织化学技术: 基本原理

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免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原 抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。
免疫 组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜 ，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
一、免疫荧光法
免疫荧光法的基本原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。常用的荧光素有①异硫氰酸荧光素（fluorecein isothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389，最大吸收光谱为490～495，最大发射光谱为520～530urn，呈现明亮的黄绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。②四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC）是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。
按照抗原抗体反应的结合步聚，免疫荧光法可分为以下三种。
1．直接法
用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以检查出相应的抗原成分。
2．间接法
先用特异性抗体与相应的抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的抗特异性抗体（间接荧光抗体）与特异性抗体相结合，形成抗原一特异性抗体一间接荧光抗体的复合物。在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体，所以，此法较直接法灵敏。
3．补体法
用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与之相结合，就形成了抗原一抗体一补体一抗补体荧光抗体的复合物。荧光显微镜下所见到的发出荧光的部分即是抗原所在的部位。补体法具有敏感性强的优势，同时适用于各种不同种属来源的特异性抗体的标记显示，在各种不同种属动物抗体的检测上为最常用的技术方法。
4．双重免疫荧光法
在对同一组织细胞标本上需要检测两种抗原时，可进行双重荧光染色，即将两种特异性抗体（例如抗A和抗B）分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记发出黄绿色荧光，抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗明达标记发出橙红色荧光，将两将荧光抗体按适当比例混合后，加在标本上（直接法）就分别形成抗原抗体复合物，发出黄绿色荧光的即抗A抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B抗体结合的部位，这样就明确显示两种抗原的定位。

二、免疫酶法
免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原（或抗体）的新技术，是在免疫荧光法的基础上发展起来的。已如前述，免疫荧光法具有操作简便、灵敏、特异性高、省时的优势，但同时也具有令人遗憾的不足，特别是荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题。为此，Nakane等人（1966）尝试了用酶代替荧光素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术（酶标抗体法）。Sternbenger等人又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的进步，成为当今使用最为广泛的免疫组织化学技术。
免疫酶法与免疫荧光法相比较，具有以下优点：酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通生物显微镜下观察，而且其产物因具有一定的电子密度也可在电镜下观察（免疫电镜技术），光镜与电镜的结合，使灵敏度进一步提高，标本又能长期保存，并能加设HE染色等其他复染，有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来（定性与定位），弥补了免疫荧光法的不足。
免疫酶法的基本原理与免疫荧光法有所相似，免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。
从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体进行免疫酶法染色，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多。sternbenger等人指出：用于标记的酶应具备以下六点：
1．酶催化的底物必需是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察。
2．酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位。
3．较易获得纯的酶分子。
4．中性PH值时，酶分子应稳定。
5．在酶标过程中，酶连接在抗体上，不能影响二者的活性。
6．被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质，否则结果将难以判定。
上述六点中以1．2两点最为重要，因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复合物。符合上述要求的，最为常用的酶是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，H：：flJ）。其次是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP），除此两种外，还有葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。