基因转染之磷酸钙-DNA共沉淀技术

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实验原理：核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核 中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM 培养液配制G418，G418浓度为200～ 800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤[方法一]：

(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备

①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。

③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml(25ml培养瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。

⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。

⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行克隆化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。

本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的，可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的基因组DNA导入受体细胞即可，其方法如下：

3、基因组DNA转染[方法二]：

(1)配制磷酸转染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用时现配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌 -20℃贮存备用

加温水至 1000mL

(2)按前面介绍的方法提取癌细胞基因组DNA。

(3)取供体基因组DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸钠，使最终浓度至0.3M混匀。

(4)再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟，去上清。

(5)加入转染缓冲液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结)，置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊兰色时，即可用于转染细胞。 (6)取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4小时，更换培养液(5ml/瓶)1次。

(7)转染：向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小时。

(8)培养：弃去培养液，用15%甘油处理3分钟，无血清培养漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。

(9)检测：逐日观察，待出现“转化灶”后，克隆分离，扩大培养建立转化细胞株。

脂质体介导DNA转染法

脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2～24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

1、操作步骤[方法一]：

(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2)转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：

(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。

(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14～24小时，

(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时。

(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

稳定的脂质体转染方法如下：

(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。

(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。

DEAE-葡聚糖转染法

DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时)，又可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。

方法如下：

(1)接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105CO2/孔/皿生长2～3天，当达50%板底面积可用。

(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo质粒DNA，空气干燥后溶于40μL的TE中，或取供体DNA。

(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生长因子血清的DMEM洗板(皿)。

(4)在80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)细胞中，使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色，培养4小时。

(5)从孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室温放置1分钟，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培养液(10%血清的DMEM)。

(6)培养细胞，在适当时间分析细胞，若含有抗药基因，可用G418选择培养液培养，方法同前。