磷酸钙-DNA共沉淀法-基因转染介绍

互联网2013-12-26

2067

二、脂质体介导DNA转染法

脂质体(lipofectin re geant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量. 作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5 μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2～24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

细胞种类：COS-7. BHK. NIH3T3. Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

1. 操作步骤[方法一]：

(1)：取6孔培养板(或用35 mm培养皿)，向每孔中加入2 mL含1～2×105 个液，37 ℃ CO2 培养至40%～60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2)转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10 μg DNA，终量100 μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50 μg LR，终量100 μL,轻轻混合A. B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

(3)转染准备：用2 mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1 mL不含血清培养液。

(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37 ℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

(5)其余处理如观察. 筛选. 检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2. 快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：

(1)以5×105 细胞/孔接种6孔板(或35 mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

①在1 mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。

(3)弃去细胞中的旧液，用1 mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1 mL DNA/脂质体复合物，37 ℃培养3～5小时。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14～24小时，

(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2 mL/孔，再培养24～48小时。

(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

稳定的脂质体转染方法如下：

(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2). (3)步骤。

(3)在每孔中加入1 mL. 20%FCS的DMEM，37 ℃培养48小时。

(4)吸出DMEM，用 g418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞筛选法进行。

DEAE-葡聚糖转染法

DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1 g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时)，又可用较低浓度(250 g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。

方法如下：

(1)接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105 CO2 /孔/皿生长2～3天，当达50%板底面积可用。

(2)乙醇沉淀的4 μg的PSV2-neo质粒DNA，空气干燥后溶于40 μL的TE中，或取供体DNA。

(3)用10 mL 1×PBS. 4 mL. 10%富合生长因子血清的DMEM洗板(皿)。

(4)在80 μl热的10 g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA，取120 μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)细胞中，使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色，培养4小时。

(5)从孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5 mL 10%DMSD，室温放置1分钟，吸出DMSO，用5 mL 1×PBS洗一次吸出，加入10 mL培养液(10%血清的DMEM)。

(6)培养细胞，在适当时间分析细胞，若含有抗药基因，可用 g418选择培养液培养，方法同前。

众所周知，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力. 物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集. 整理. 分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。