基因转染(磷酸钙-DNA共沉淀法)

磷酸钙-DNA 共沉淀法

核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使DNA 附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA 仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA 可以与细胞DNA 整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA 导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2 PO4 、2H2 O

加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤[方法一]：

(1)供体DNA 制备：方法按前介绍的DNA 提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

(3)DNA -磷酸钙沉淀物的制备

①将供体细胞DNA 和PSV2-neo质粒载体DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液，同时向供体细胞DNA 液200μl中加入带基因neo质粒DNA 液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA 溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。

③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。

②吸取0.5ml DNA -磷酸钙沉淀，加入含5ml培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2 培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA -磷酸钙结晶颗粒。

④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。