材料与仪器
真核细胞
CaCl2 HEPES缓冲液 氯化铯 PBS
培养箱 锥形管 离心管
CaCl2 HEPES缓冲液 氯化铯 PBS
培养箱 锥形管 离心管
步骤
1. 在转染前一天将细胞分入10 cm 组织培养平板中。当被转染的细胞是贴壁细胞,倍增时间为18~24 h时,一般按1:15从长满的培养皿中分细胞效果较好,转染的当天,细胞应在培养皿中很好地分散分布。在加入沉淀前2~4 h,用9 ml 完全培养液培养细胞。
2. 将要转染的DNA用乙醇沉淀,空气中晾干沉淀。将DNA沉淀重悬于450 μl 无菌水中,加50 μl 2.5 mol/l CaCl2。
3. 加500 μl 2×HeBS于一无菌的15 ml 锥形管中,将机械式移液器安上1 ml 吸头, 一边吹打2XHeBS,一边用巴斯德吸管逐滴加入DNA/CaCl2溶液,随即在漩涡混合器上振荡5 s,将其在室温下静置20 min 以形成沉淀。
4. 将沉淀均匀加入10 cm 平板的细胞中,轻轻晃动。
4. 将沉淀均匀加入10 cm 平板的细胞中,轻轻晃动。
5. 在标准生长条件下培养细胞4~16 h,除去培养液,用5 ml 1×PBS洗细胞2次,加 10 ml 完全培养液培养细胞。
6. 对于短暂分析实验,可在既定的时刻收集细胞。对于稳定转化,让细胞生长两个倍增时间后分入培养皿中进行选择培养。
常见问题
磷酸钙沉淀的形成
来源:丁香实验