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磷酸钙法转染HEK293T细胞

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7881

一.试剂配制

无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;

2XHBS: 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;

2M CaCl2: 过滤灭菌,分装。

二. 实验过程:

1. 铺细胞: 选择状态良好的293T细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish。

2. 20-24h后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染。下面就35mm dish为例,采用以下转染体系:

ddw: 105ul

plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)

2M CaCl2: 16.5ul

2XHBS: 125ul

按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。

先将前三者混匀, 最后加2XHBS。

一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。

另一种方法是, 加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。

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