用51Cr铬酸钠标记靶细胞
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一、用51Cr铬酸钠标记靶细胞
短期标记法
1.用RPMI-1640 培养液洗涤107靶细胞,去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi(3.7MBq)51Cr铬酸钠,37℃水浴中标记1小时,每5~10分钟摇晃一次,混匀细胞。
2.如上用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次,每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞,置37℃水浴30分钟,以减少非特异的自然释放。
3.离心200×g 10分钟,去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞,尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率,将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。
二、4小时51Cr释放实验
1.在96孔圆底细胞培养 板中加入51Cr标记的靶细胞,每孔加100μl。
2.向各孔加100μl效应细胞,效应细胞与靶细胞的比例(效靶比,E:T)根据要求而定,通常为5:1~20:1。阴性对照孔(自然释放)不加效应细胞只加100μl完全培养液,阳性对照孔(最大释放)中加100μ1%NP40(或2%SDS,1mol/L盐酸)。每个实验置三个复孔。
3.稍稍离心(100×g 3分钟)后,置37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养4小时。
4.离心培养板200×g 10分钟,每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中,在γ-计数仪上(或液闪计数仪上)测定上清液中的每分钟放射性活性(cpm值)。
3)特异性杀伤活性的计算
1.用细胞毒性百分比表示:细胞毒性(%)=