51bp的小片段酶连到我构建的pet30a spycatcher载体（5500多bp )中失败

我是将我的一个51bp的小片段连接到我构建的pet30a spycatcher载体（5500多bp )中，我连接了两次都有菌落长出，第一个就长了7个菌落，第二个板子上大约有15个左右的菌落，我菌p的两个板子都有与目的片段对应的菌落，然后我对这些菌落提质粒，在对质粒进行PCR，跑胶没有我的目的条带，这个是怎么回事？是我哪里出现了问题？要怎么解决

1.我的51bp的小片段的PCR的跑胶结果特别亮，但是提的质粒PCR跑胶一点都没有

2.我的双酶切载体的浓度为23ng/ul，我加了5ul，酶切后的目的基因浓度为3ng/ul，我加了2ul，我的酶连比例用的是1:4（大片段：目的基因），酶连温度时间：22度2小时，酶连总体系20ul，将全部酶连产物打入感受态当中，转化涂板

3.我将双酶切的的pet30a spycatcher载体转化涂板，没有菌落长出，说明双酶切完全

4.我也做了提出的质粒单酶切，以及质粒单独跑胶，单酶切在5000bp 左右有一个条带，质粒单独跑胶有三个条带

谢谢各位🙏，目前实验处在瓶颈期，请求大家帮忙