去壁低渗法制备植物染色体标本实验

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一、实验目的：
1、掌屋植物染色体 标本的去壁低渗方法
2、了解中期染色体的形态结构
二、实验原理：
植物 细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上，可通过纤维素酶和果胶酶处理去掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。陈瑞阳等（1979，1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗法，并在多种植物上得到广泛应用，成为当前植物染色体研究中的重要方法。
三、实验用品：
（一）器材：
显微镜；温箱；冰箱；重蒸水；眼科镊子；刀片；牙签；载玻片；试剂瓶；三角瓶；量筒；酒精灯；青霉素小瓶
（二）药品：
1、0.2%秋水仙素溶液
2、Giemsa原液:取Giemsa粉0.5g加入33ml优质并三醇于研钵中,充分研磨1小时,然后在56℃温箱中保温2小时,再加入33ml甲醇(GR或AR级),混匀后装入棕色瓶中保存备用,贮存时间越久越好.
3、甲醇（AR级以上）
4、冰醋酸（AR级以上）
5、0.075mol/L氯化钾:称取氯化钾5.592g,置于容量瓶内加蒸馏水至1000ml
6、磷酸缓冲液 ：
A液：0.067mol/L磷酸氢二钾
B液: 0.067mol/L磷酸氢二钠
用时将13mlA液和87mlB液混匀即得pH7.6的PBS液
7、Giemsa染色液（染色前临时配制）：100mlPBS液+3-5mlGiemsa原液
8、混合酶液：称取纤维素酶，果胶酶各0.5g,加入20ml蒸馏水即为2.5%混合酶液,冰箱内冰冻保存
四、实验材料:
大麦或玉米种子
五、方法步骤：
1、材料培养：将玉米或大麦的种子充分浸种后，摆在铺有滤纸的培养皿内，在25℃温箱发芽培养
2、预处理：待根长至0.5-1cm时,切取根尖立即放入盛有1ml0.2%秋水仙素的小瓶中预处理2-3小时
3、前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯化钾低渗液中，在25℃条件下处理30分钟。以下可分两种方法进行处理
4、第一种方法：
（1）、酶解去壁：吸去氯化钾溶液，加入混合酶液（2ml滴管5滴左右），在25℃下处理1-2小时。
（2）、后低渗：吸去酶液，慢慢加入(25±0.5) ℃的双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10-30分钟
5、第二种方法：
（1）吸去前低渗液，立即加入甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定20-30分钟
（2）水洗：将固定好的材料用蒸馏水洗三次，除去材料中的固定液
（3）酶解去壁：在小瓶内加入混合酶液（酶液量以浸过材料为合适），在25℃下酶解30-60分钟
（4）后低渗：同4、（2），但是，可适当延长时间至1-1.5小时。
6、经过上述两种方法处理的材料,可用两种方法制备染色体标本
1）、第一种方法,涂片法:
（1）固定：将后低渗好的材料，直接用甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定30分钟以上
（2）涂片：将材料放在预先用蒸馏水浸泡并冷冻的清洁载玻片上，加1滴固定液，然后用镊子迅速将材料夹碎涂布，并去掉大块组织残渣
（3）火焰干燥：立即将载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干
（4）染色：经干燥的玻片标本，用Giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水细流冲洗，甩干水珠空气干燥。
2）、第二种方法，悬液法：
（1）制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液
（2）固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液1-2ml，使成细胞悬液
（3）去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层细胞悬液于另一个小瓶中。
（4）去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上清夜，留约0.5ml左右细胞悬液置备标本
(5)标本制备:在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用吸管滴2-3滴细胞悬液,立即将载玻片一端抬起,并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干。
（6）染色：同涂片法（4）
7、在显微镜下寻找典型的中期染色体，注意观察中期染色体的长臂、短臂和着丝粒位置，并尽可能找到具随体染色体。
实验步骤流程如下：

六、注意事项：
1、预处理是很重要的一个步骤，必要时可将预处理药品直接加到培养皿内进行活体处理3—4小时，以便获得更多的中期分裂相。