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去壁低渗法制备植物染色体标本实验

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一、实验目的:
1、掌屋植物染色体标本的去壁低渗方法
2、了解中期染色体的形态结构
二、实验原理:
植物细胞有很坚实的细胞壁,染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上,可通过纤维素酶和果胶酶处理去掉细胞壁;用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。陈瑞阳等(1979,1982)提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗法,并在多种植物上得到广泛应用,成为当前植物染色体研究中的重要方法。
三、实验用品:
(一)器材:
显微镜;温箱;冰箱;重蒸水;眼科镊子;刀片;牙签;载玻片; 试剂 瓶;三角瓶;量筒;酒精灯;青霉素小瓶
(二)药品:
1、0.2%秋水仙素溶液
2、Giemsa原液:取Giemsa粉0.5g加入33ml优质并三醇于研钵中,充分研磨1小时,然后在56℃温箱中保温2小时,再加入33ml甲醇(GR或AR级),混匀后装入棕色瓶中保存备用,贮存时间越久越好.
3、甲醇(AR级以上)
4、冰醋酸(AR级以上)
5、0.075mol/L氯化钾:称取氯化钾5.592g,置于容量瓶内加 蒸馏 水至1000ml
6、磷酸缓冲液:
A液:0.067mol/L磷酸氢二钾
B液: 0.067mol/L磷酸氢二钠
用时将13mlA液和87mlB液混匀即得pH7.6的PBS液
7、Giemsa染色液(染色前临时配制):100mlPBS液+3-5mlGiemsa原液
8、混合酶液:称取纤维素酶,果胶酶各0.5g,加入20ml 蒸馏 水即为2.5%混合酶液,冰箱内冰冻保存
四、实验材料:
大麦或玉米种子
五、方法步骤:
1、材料培养:将玉米或大麦的种子充分浸种后,摆在铺有滤纸的培养皿内,在25℃温箱发芽培养
2、预处理:待根长至0.5-1cm时,切取根尖立即放入盛有1ml0.2%秋水仙素的小瓶中预处理2-3小时
3、前低渗:切取分裂旺盛的部分根尖(1mm),放入0.075mol/L氯化钾低渗液中,在25℃条件下处理30分钟。以下可分两种方法进行处理
4、第一种方法:
(1)、酶解去壁:吸去氯化钾溶液,加入混合酶液(2ml滴管5滴左右),在25℃下处理1-2小时。
(2)、后低渗:吸去酶液,慢慢加入(25±0.5) ℃的双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10-30分钟
5、第二种方法:
(1)吸去前低渗液,立即加入甲醇:冰醋酸(3:1)固定液固定20-30分钟
(2)水洗:将固定好的材料用蒸馏水洗三次,除去材料中的固定液
(3)酶解去壁:在小瓶内加入混合酶液(酶液量以浸过材料为合适),在25℃下酶解30-60分钟
(4)后低渗:同4、(2),但是,可适当延长时间至1-1.5小时。
6、经过上述两种方法处理的材料,可用两种方法制备染色体标本
1)、第一种方法,涂片法:
(1)固定:将后低渗好的材料,直接用甲醇:冰醋酸(3:1)固定液固定30分钟以上
(2)涂片:将材料放在预先用蒸馏水浸泡并冷冻的清洁载玻片上,加1滴固定液,然后用镊子迅速将材料夹碎涂布,并去掉大块组织残渣
(3)火焰干燥:立即将载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干
(4)染色:经干燥的玻片标本,用Giemsa染色液染色30分钟,然后用自来水细流冲洗,甩干水珠空气干燥。
2)、第二种方法,悬液法:
(1)制备细胞悬液:倒去双蒸水,用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液
(2)固定:向细胞中加入新配制的甲醇:冰醋酸(3:1)固定液1-2ml,使成细胞悬液
(3)去沉淀:静置片刻使大块组织沉淀,然后取上层细胞悬液于另一个小瓶中。
(4)去上清夜:将上层细胞悬液静置30分钟左右,即可见细胞沉淀,用 吸管 轻轻吸去上清夜,留约0.5ml左右细胞悬液置备标本
(5)标本制备:在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用 吸管 滴2-3滴细胞悬液,立即将载玻片一端抬起,并轻轻吹气,使细胞迅速分散,然后在酒精灯火焰上微微加热烤干。
(6)染色:同涂片法(4)
7、在显微镜下寻找典型的中期染色体,注意观察中期染色体的长臂、短臂和着丝粒位置,并尽可能找到具随体染色体。
实验步骤流程如下:

六、注意事项:
1、预处理是很重要的一个步骤,必要时可将预处理药品直接加到培养皿内进行活体处理3—4小时,以便获得更多的中期分裂相。
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