原位末端转移酶标记技术检测凋亡

<font>（一）原理</font>

<font>凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将<span><b>DNA</b> </span> 切割成许多双链<span><b>DNA</b> </span> 片段以及高分子量<span><b>DNA</b> </span> 单链断裂点（缺口），暴露出大量<span>3-</span> 羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（<span>TdT</span> ）将标记的<span>dUTP</span> 进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。</font>

<font>（二）荧光标记法</font>

<font><span>1</span> <span>．材料与试剂<span><span> </span> </span> 采用德国<span>Boehringer-Mannheim</span> 公司<span>In Situ Cell Death Detection </span> 试剂盒，或美国<span>Oncor</span> 公司<span>ApopTag^TM </span> 试剂盒，包括：</span></font>

<font><span><font>⑴生物素标记的<span>-Dutp(Biotin-dUTP)</span> 或地高辛标记的<span>-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)</span> １<span>nmol/µl</span></font></span></font>

<font><span><font>⑵<span> TdT</span> 酶（<span>25U/</span> μ<span>l</span> ）</font></span></font>

<font><span><font>⑶ 反应缓冲液</font></span></font>

<font><span><font>⑷ 洗涤缓冲液</font></span></font>

<font><span><font>⑸ 异硫氰酸荧光素（<span>FITC</span> ）标记的亲合素或链霉亲合素（<span>2.5µg/ml</span> ）或抗地高辛抗体（<span>1</span> �<span>30</span> ）</font></span></font>

<font><span><font>⑹<span> PI</span> 染液（含<span>PI 5µg/ml</span> 及无<span><b>DNA</b> </span> 酶活性的<span>RNA</span> 酶<span>0.1%</span> ）</font></span></font>

<font><span><font>⑺<span> PBS</span> 缓冲液</font></span></font>

<font><span><font>⑻ 塑料盖玻片</font></span></font>

<font><font><span>2.</span> <span>样品</span></font></font>

<font><span><font><font>⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片</font> </font> </span> </font>

<font><span><font>⑵ 贴壁生长的培养细胞</font></span></font>

<font><span><font>⑶ 冰冻切片</font></span></font>

<font><span><font>⑷ 常规石蜡切片</font></span></font>

<font><font><span>3.</span> <span>操作方法</span></font></font>

<font><span><font>（<span>1</span> ）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用<span>4%</span> 多聚甲醛固定<span>30min(4</span> ℃<span>)</span> 后，用<span>80%</span> 酒精再固定<span>2h</span> （<span>-20</span> ℃）。常规<span>4%</span> 中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>2</span> ）洗涤：玻片浸入<span>PBS</span> 缓冲液，摇床上洗涤<span>5min,</span> 三次。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>3</span> ）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按<span>50</span> μ<span>l/</span> �^{<span>2</span>} 滴加反应液（每<span>50</span> μ<span>l</span> 反应液含<span>TdT</span> 酶<span>0.5</span> μ<span>l,</span> 标记的<span>-dUTP 1</span> μ<span>l</span> ）<span>,</span> 使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上<span>,</span> 盖上塑料盖玻片<span>,</span> 置湿盒中<span>,37</span> ℃孵育<span>1h</span> 。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>4</span> ）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次<span>5min</span> 。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>5</span> ）<span>FITC</span> 标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按<span>50</span> μ<span>l/</span> �^{<span>2</span>} 滴加<span>FITC</span> 反应液（含<span>FITC 2.5</span> μ<span>g/ml</span> ），室温下避光孵育<span>10min</span> 。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>6</span> ）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次<span>5min</span> 。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>7</span> ）<span>PI</span> 复染：将玻片置于盛有<span>PI</span> 染液的染色缸内，室温下避光染色<span>30min</span> 。</font></span></font>

<font><span><font>（<span>8</span> ）封片：用盖玻片直接盖在含<span>PI</span> 染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。</font></span></font>

<font><font><span><font>4.</font> </span> <span><font>结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长<span>488nm</span> ），所有的细<span>胞核均被<span>PI</span> 着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上<span>FITC</span> ，显示出黄绿色荧光。</span> </font> </span> </font> </font>

<font><font><span><font><b><span>(</span> </b> <b><span>三<span>)</span> 酶标记法</span></b></font></span></font></font>

<font><font><span><font><span>1.</span> <span>材料与试剂<span><span> </span> </span> 采用美国<span>Oncor</span> 公司<span>ApopTag^TM -Peroxidase</span> 试剂盒，包括：</span></font></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑵ 反应缓冲液</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑶<span> TdT</span> 酶</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑷ 反应终止<span>/</span> 洗涤液</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑸ 平衡缓冲液</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑹ 蛋白酶<span>K</span> 消化液：<span>20</span> μ<span>g/ml</span> 蛋白酶<span>K</span> 溶于<span>PBS</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑺<span> 30% H₂ O₂ </span></font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑻<span> DAB</span> 显色液：<span>0.05%</span> 的<span>diaminobenzidine(DAB)</span> 溶于<span>PBS</span> ，用前过滤并加入</font></span></span></font></font>

<font><font><span><font><span>0.02% H₂ O₂ </span> <span>。</span></font></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑼ 甲基绿染液：<span>0.5%</span> 甲基绿溶于<span>0.1Mol/L</span> 枸橼酸钠，<span>pH</span> 调整到<span>4.0</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片</font></span></span></font></font>

<font><font><span><font><span>2</span> <span>．样品<span><span> </span> </span> 同荧光标记法。</span></font></span></font></font>

<font><font><span><font><span>3</span> <span>．操作方法</span></font></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑴ 固定：同荧光标记法。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font><font>⑵ 内源性过氧化物封闭<span><span> </span> </span> 玻片置于盛有<span>0.5% H₂ O₂ </span> 缓冲溶液的染色缸内，室温下作用<span>20min</span> 后，同荧光标记法洗涤。</font> </font> </span> </span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶<span>K</span> 消化液的染色缸，室温下消化<span>15min</span> ，洗涤</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>同上。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按<span>70µl</span> ／<span>cm² </span> ）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用<span>5min</span> ～<span>10min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按<span>50µl/</span> �^{<span>2</span>} ，<span>18</span> μ<span>l TdT</span> 酶<span> 36</span> μ<span>l</span> 反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，<span>37</span> ℃温育<span>1h</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止<span>/</span> 洗涤液的染色缸内，<span>37</span> ℃下洗涤<span>30min</span> （置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次<span>5min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加<span>70</span> μ<span>l</span> 过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育<span>30min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次<span>5min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的<span>DAB</span> 显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用<span>3min</span> ～<span>6min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤<span>3</span> 次，每次<span>3min</span> ～<span>6min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色<span>10min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤<span>3</span> 次（置于摇床上），每次<span>2min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>⒀ 脱水、封片：<span>100%</span> 正丁醇，<span>3</span> 次，每次<span>2min</span> 。二甲苯，<span>3</span> 次，每次<span>2min</span> 。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><span><font>明胶甘油封片。</font></span></span></font></font>

<font><font><span><font><span>4</span> <span>．结果判定<span><span> </span> </span> 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染<span>色质显示出特异性的棕黄色。</span> </span> </font> </span></font></font>

<font><font><span> </span></font></font>

<font><font><span><font><span><span><span><font><strong>细胞凋亡相关产品及资料</strong> </font> </span> </span> </span> </font> </span></font></font>

• <font><font><span><font>肿瘤抑制/细胞凋亡相关抗体</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>特异性siRNA库-细胞凋亡类</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>细胞凋亡检测试剂</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>细胞增殖检测试剂</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>流式细胞检测</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>荧光染料和淬灭剂</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>活性染料和化合物</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>激光共聚焦显微镜</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>电子显微镜</font> </span></font></font>
• <font><font><span><font>组织染色</font> </span></font></font>