简介
原位末端标记法检测细胞凋亡是 TdT 能催化 DNA 链的 3＇-OH 端加脱氧核糖核苷酸（dNTP）的聚合反应。将地高辛配基偶联于 dUTP（Dig-dUTP），在 TdT 的催化下，Dig-dUTP 的核苷酸基加合到 DNA 缺口处或断端形成的 3＇-OH 上，同时释放出焦磷酸（ppi）。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体，通过抗原抗体反应与地高辛配基结合，3＇，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，即可在普通光学显微镜下观察到其染色质 DNA 存在缺口或断裂的细胞。
原理
原位末端标记法检测细胞凋亡的基本原理是在凋亡早期，激活的细胞内源性的核酸内切酶，作用于染色质核小体间的 DNA，使其产生缺口，甚至断裂。TdT 能催化 DNA 链的 3＇-OH 端加脱氧核糖核苷酸（dNTP）的聚合反应。将地高辛配基偶联于 dUTP（Dig-dUTP），在 TdT 的催化下，Dig-dUTP 的核苷酸基加合到 DNA 缺口处或断端形成的 3＇-OH 上，同时释放出焦磷酸（ppi）。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体，通过抗原抗体反应与地高辛配基结合，3＇，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，即可在普通光学显微镜下观察到其染色质 DNA 存在缺口或断裂的细胞。
材料与仪器
步骤
原位末端标记法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：
A 样品处理玻片预先用多聚赖氨酸或 APES 进行处理。制备细胞涂片（见基本方案 1）：4％ 多聚甲醛-0.1 mol/L PBS（pH7.4）室温固定 1 h。
B PBS 洗 3 x 5 min。
C 3％ H2O2 室温处理 10 min，封闭内源过氧化物酶活性。PBS 洗 2 x 3 min。
D 蛋白酶K 室温处理 10～60 s，PBS 洗 3 x 3 min。
E 加 30 μL 孵育液，Parafilm 膜覆盖，室温孵育 10 min。取下 Parafilm膜，用纸巾吸去水。
F 4 μL 5 x TdT 反应缓冲液＋1 μL TdT＋1 μL Dig-dUTP＋14 μL 双蒸水，混匀后滴加在标本上，Parafilm 膜覆盖，37 ℃ 孵育 1～2 h。取下Parafilm 膜，PBS 洗 3 x 2 min。
G 加 20～50 μL 5 U/mL 的辣根过氧化物酶偶联的地高辛抗体，Parafilm 膜覆盖，37 ℃ 孵育 30 min。取下 Parafilm 膜，PBS 洗 3 x 2 min。
H 0.04％ 的 DAB 显色 5～10 min，镜下控制时间。过量的水清洗。
I 苏木精（或甲基绿）轻度复染 30 s～3 min。过量的水清洗。
J 常规脱水、透明、封片。普通显微镜下观察。
注意事项
1 多聚甲醛、DAB：致癌。应戴手套，在通风橱操作。
2 废弃物和废液应单独存放。
来源：丁香实验
