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原位末端标记法检测细胞凋亡

相关实验:基于细胞核DNA变化检测细胞凋亡

最新修订时间:

简介

原位末端标记法检测细胞凋亡是 TdT 能催化 DNA 链的 3'-OH 端加脱氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反应。将地高辛配基偶联于 dUTP(Dig-dUTP),在 TdT 的催化下,Dig-dUTP 的核苷酸基加合到 DNA 缺口处或断端形成的 3'-OH 上,同时释放出焦磷酸(ppi)。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体,通过抗原抗体反应与地高辛配基结合,3',3-二氨基联苯胺(DAB)显色,即可在普通光学显微镜下观察到其染色质 DNA 存在缺口或断裂的细胞。

原理

原位末端标记法检测细胞凋亡的基本原理是在凋亡早期,激活的细胞内源性的核酸内切酶,作用于染色质核小体间的 DNA,使其产生缺口,甚至断裂。TdT 能催化 DNA 链的 3'-OH 端加脱氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反应。将地高辛配基偶联于 dUTP(Dig-dUTP),在 TdT 的催化下,Dig-dUTP 的核苷酸基加合到 DNA 缺口处或断端形成的 3'-OH 上,同时释放出焦磷酸(ppi)。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体,通过抗原抗体反应与地高辛配基结合,3',3-二氨基联苯胺(DAB)显色,即可在普通光学显微镜下观察到其染色质 DNA 存在缺口或断裂的细胞。

材料与仪器

器材:


① 载玻片


② 盖玻片


③ 计数板


④ 10 mL 吸管


⑤ 吸管橡皮球


⑥ 10 mL 离心管


⑦ 微量移液器吸头


⑧ 滴管


⑨ 滴管橡皮头


⑩ 盖玻片


⑪ Parafilm 膜


⑫ 湿盒


⑬ 微量移液器及其吸头


⑭ 普通显微镜


⑮ HeLa 细胞(或别的细胞)。


试剂:


① 中性树脂凋亡诱导剂(根据情况自定)


② 消化液(0.02% EDTA)


③ PBS、4% 多聚甲醛(0.1 mol/L PBS,pH7.4)


④ 3% H2O2(避光保存)


⑤ 蛋白酶 K


⑥ 孵育液


(100 mmol/L 二甲胂酸钾(pH7.2),2 mmol/L CoCl2,0.2 mmol/L DTT,150 mmol/L NaC1,0.05% BSA)


⑦ 5 x TdT 反应缓冲液


(500 mmol/L 二甲胂酸钾(pH7.2),10 mmol/L CoCl2,1 mmol/L DTT。)


⑧ 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)(4U/μL)


⑨ Dig-dUTP(40~80 μmol/L)


⑩ 双蒸水


⑪ 10 x DAB-H2O2 显色液


(0.1 mol/L Tris-Cl(pH7.6),0.4% DAB,-20 ℃ 避光保存,用前稀释 10 倍并加入 H2O2。)


⑫ 苏木精染液

步骤

原位末端标记法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步:


A 样品处理玻片预先用多聚赖氨酸或 APES 进行处理。制备细胞涂片(见基本方案 1):4% 多聚甲醛-0.1 mol/L PBS(pH7.4)室温固定 1 h。


B PBS 洗 3 x 5 min。


C 3% H2O2 室温处理 10 min,封闭内源过氧化物酶活性。PBS 洗 2 x 3 min。


D 蛋白酶K 室温处理 10~60 s,PBS 洗 3 x 3 min。


E 加 30 μL 孵育液,Parafilm 膜覆盖,室温孵育 10 min。取下 Parafilm膜,用纸巾吸去水。


F 4 μL 5 x TdT 反应缓冲液+1 μL TdT+1 μL Dig-dUTP+14 μL 双蒸水,混匀后滴加在标本上,Parafilm 膜覆盖,37 ℃ 孵育 1~2 h。取下Parafilm 膜,PBS 洗 3 x 2 min。


G 加 20~50 μL 5 U/mL 的辣根过氧化物酶偶联的地高辛抗体,Parafilm 膜覆盖,37 ℃ 孵育 30 min。取下 Parafilm 膜,PBS 洗 3 x 2 min。


H 0.04% 的 DAB 显色 5~10 min,镜下控制时间。过量的水清洗。


I 苏木精(或甲基绿)轻度复染 30 s~3 min。过量的水清洗。


J 常规脱水、透明、封片。普通显微镜下观察。

注意事项

1 多聚甲醛、DAB:致癌。应戴手套,在通风橱操作。


2 废弃物和废液应单独存放。

来源:丁香实验

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