原位末端标记法检测细胞凋亡

最新修订时间：2022-02-10

简介

原位末端标记法检测细胞凋亡是 TdT 能催化 DNA 链的 3＇-OH 端加脱氧核糖核苷酸（dNTP）的聚合反应。将地高辛配基偶联于 dUTP（Dig-dUTP），在 TdT 的催化下，Dig-dUTP 的核苷酸基加合到 DNA 缺口处或断端形成的 3＇-OH 上，同时释放出焦磷酸（ppi）。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体，通过抗原抗体反应与地高辛配基结合，3＇，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，即可在普通光学显微镜下观察到其染色质 DNA 存在缺口或断裂的细胞。

原理

原位末端标记法检测细胞凋亡的基本原理是在凋亡早期，激活的细胞内源性的核酸内切酶，作用于染色质核小体间的 DNA，使其产生缺口，甚至断裂。TdT 能催化 DNA 链的 3＇-OH 端加脱氧核糖核苷酸（dNTP）的聚合反应。将地高辛配基偶联于 dUTP（Dig-dUTP），在 TdT 的催化下，Dig-dUTP 的核苷酸基加合到 DNA 缺口处或断端形成的 3＇-OH 上，同时释放出焦磷酸（ppi）。使用辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体，通过抗原抗体反应与地高辛配基结合，3＇，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，即可在普通光学显微镜下观察到其染色质 DNA 存在缺口或断裂的细胞。

材料与仪器

器材：

① 载玻片

② 盖玻片

③ 计数板

④ 10 mL 吸管

⑤ 吸管橡皮球

⑥ 10 mL 离心管

⑦ 微量移液器吸头

⑧ 滴管

⑨ 滴管橡皮头

⑩ 盖玻片

⑪ Parafilm 膜

⑫ 湿盒

⑬ 微量移液器及其吸头

⑭ 普通显微镜

⑮ HeLa 细胞（或别的细胞）。

试剂：

① 中性树脂凋亡诱导剂（根据情况自定）

② 消化液（0.02％ EDTA）

③ PBS、4％多聚甲醛（0.1 mol/L PBS，pH7.4）

④ 3％ H₂O₂（避光保存）

⑤ 蛋白酶 K

⑥ 孵育液

（100 mmol/L 二甲胂酸钾（pH7.2），2 mmol/L CoCl₂，0.2 mmol/L DTT，150 mmol/L NaC1，0.05% BSA）

⑦ 5 x TdT 反应缓冲液

（500 mmol/L 二甲胂酸钾（pH7.2），10 mmol/L CoCl₂，1 mmol/L DTT。）

⑧ 末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）（4U/μL）

⑨ Dig-dUTP（40～80 μmol/L）

⑩ 双蒸水

⑪ 10 x DAB-H₂O₂ 显色液

（0.1 mol/L Tris-Cl（pH7.6），0.4％ DAB，-20 ℃ 避光保存，用前稀释 10 倍并加入 H₂O₂。）

⑫ 苏木精染液

步骤

原位末端标记法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：

A 样品处理玻片预先用多聚赖氨酸或 APES 进行处理。制备细胞涂片（见基本方案 1）：4％多聚甲醛-0.1 mol/L PBS（pH7.4）室温固定 1 h。

B PBS 洗 3 x 5 min。

C 3％ H₂O₂室温处理 10 min，封闭内源过氧化物酶活性。PBS 洗 2 x 3 min。

D 蛋白酶K 室温处理 10～60 s，PBS 洗 3 x 3 min。

E 加 30 μL 孵育液，Parafilm 膜覆盖，室温孵育 10 min。取下 Parafilm膜，用纸巾吸去水。

F 4 μL 5 x TdT 反应缓冲液＋1 μL TdT＋1 μL Dig-dUTP＋14 μL 双蒸水，混匀后滴加在标本上，Parafilm 膜覆盖，37 ℃ 孵育 1～2 h。取下Parafilm 膜，PBS 洗 3 x 2 min。

G 加 20～50 μL 5 U/mL 的辣根过氧化物酶偶联的地高辛抗体，Parafilm 膜覆盖，37 ℃ 孵育 30 min。取下 Parafilm 膜，PBS 洗 3 x 2 min。

H 0.04％的 DAB 显色 5～10 min，镜下控制时间。过量的水清洗。

I 苏木精（或甲基绿）轻度复染 30 s～3 min。过量的水清洗。

J 常规脱水、透明、封片。普通显微镜下观察。

注意事项

1 多聚甲醛、DAB：致癌。应戴手套，在通风橱操作。

2 废弃物和废液应单独存放。

来源：丁香实验