酶标记法检测细胞凋亡
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[材料与试剂]
(1)平衡缓冲液;
(2)反应缓冲液;
(3)TdT酶;
(4)反应终止/洗涤液;
(5)过氧化物酶标记的抗地高辛抗体;
(6)蛋白酶K消化液:20μg/ml蛋白酶K溶于PBS;
(7)30%H2 O2 ;
(8)DAB显色液:0.05%的diaminobenzidine (DAB)溶于PBS,用前过滤并加入0.02%H2 O2 ;
(9)甲基绿染液:0.5%甲基绿溶于0.1mol/L枸橼酸钠,pH调整到4.0;
(10)塑料盖玻片及玻璃盖玻片。
[样品来源]
同荧光标记法。
[操作步骤]
(1)固定:同荧光标记法;
(2)内源性过氧化物酶封闭:玻片置于盛有0.5%H2 O2 缓冲液的染色缸内,室温下作用20min 后,同荧光标记法洗涤;
(3)消化:玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸,室温下消化15min,同上洗涤;
(4)平衡处理:将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干,滴加平衡缓冲液(按70μl/cm2 )覆盖细胞或组织表面,盖上塑料盖玻片,室温下作用5~10min;
(5)反应:移去盖玻片,倾去平衡液,用吸水纸吸干周围液体,滴加反应液(按50μl/cm2,18μl TdT酶+36μl反应缓冲液),均匀覆盖在细胞或组织上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃温育1h;
(1)平衡缓冲液;
(2)反应缓冲液;
(3)TdT酶;
(4)反应终止/洗涤液;
(5)过氧化物酶标记的抗地高辛抗体;
(6)蛋白酶K消化液:20μg/ml蛋白酶K溶于PBS;
(7)30%H2 O2 ;
(8)DAB显色液:0.05%的diaminobenzidine (DAB)溶于PBS,用前过滤并加入0.02%H2 O2 ;
(9)甲基绿染液:0.5%甲基绿溶于0.1mol/L枸橼酸钠,pH调整到4.0;
(10)塑料盖玻片及玻璃盖玻片。
[样品来源]
同荧光标记法。
[操作步骤]
(1)固定:同荧光标记法;
(2)内源性过氧化物酶封闭:玻片置于盛有0.5%H2 O2 缓冲液的染色缸内,室温下作用20min 后,同荧光标记法洗涤;
(3)消化:玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸,室温下消化15min,同上洗涤;
(4)平衡处理:将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干,滴加平衡缓冲液(按70μl/cm2 )覆盖细胞或组织表面,盖上塑料盖玻片,室温下作用5~10min;
(5)反应:移去盖玻片,倾去平衡液,用吸水纸吸干周围液体,滴加反应液(按50μl/cm2,18μl TdT酶+36μl反应缓冲液),均匀覆盖在细胞或组织上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃温育1h;
(6)终止反应:移去盖玻片,将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内,37℃下洗涤30min(置摇床上振摇)。然后将玻片置于洗涤缓冲液内,洗2次,每次5min。
(7)地高辛抗体反应:用吸水纸吸干细胞或组织周围液体,滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体,均匀覆盖,加上塑料盖玻片,室温下置湿盒中孵育30min;
(8)洗涤:置于洗涤缓冲液内,洗2次,每次5min;
(9)用吸水纸吸干细胞或组织四周液体,滴加新鲜配制的DAB显色液,均匀覆盖,加盖塑料盖玻片,室温下作用3~6min;
(10)洗涤:置于蒸馏水中洗三次,每次3~6min;
(11)套染:将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中,室温下染色10min;
(12)洗涤:蒸馏水洗涤三次(置摇床上),每次2min;
(13)脱水、封片:100%正丁醇,三次,每次2min;二甲苯,三次,每次2min;明胶甘油封片;
[结果判断]
光学显微镜下观察,所有细胞核均着绿色,凋亡细胞核染色质显示出特异性的棕黄色。