酶标记 A 蛋白纯品

HRP 可以于共价键或非共价键方式黏附在其他的蛋白质分子上，常见的标记方法有戊二醛一步法和二步法，也可以用过碘酸钠氧化法，它们主要为共价键结合方式；另一种为非共价键结合方式，是用 4，4'-二氟-3，3'-二硝基苯基砜（4，4'-difluoro-3，3'-dinitrophenyl sulfone，FNPS）作为交联试剂。戊二醛二步法的标记效率要高于一步法，过碘酸钠氧化法的标记效率要高于戊二醛二步法。其主要原理是二种蛋白质分子的赖氨酸上的 e 基团和含氨基的 N 端经活化剂活化而结合。由于抗体和酶分子上所具有的反应基团很少，需通过功能基团（如戊二醛）将更多的抗体和酶分子结合在一起，酶分子首先和双功能试剂结合，再与抗体分子结合，这样可以结合更多的酶和抗体，而且无聚合物产生。HRP 还可以与生物素和亲和素结合。

1. 取 HRP 5 mg，溶于 0.1 ml 新鲜配制的 0.3 mol/L（pH 3.1）NaHCO₃ 中，加 0.1 ml 1％ 二硝基氟苯-无水乙醇，于室温中避光轻轻搅拌 1 h。

2. 再加入 0.08 mol/L NaIO₃ 1 ml，室温中搅拌 30 min。

3. 再加 0.08 mol/L 乙二醇 1 ml，混匀后轻轻搅拌 1 h。

4. 装入透析袋中，在 4℃ 条件下，用 0.01 mol/L（pH 9.5）碳酸盐缓冲溶液 1500 ml 于 2000 ml 烧杯中透析。

5. 称取纯品 SPA 5 mg，加入上述经醛化的 HRP 中，在 25℃ 下充分混匀，轻轻搅拌 5 h。

6. 加 5 mg NaBH₄，置于 4℃ 3 h。

7. 结合物用 0.02 mol/L，（pH 7.4）PBS 透析（4℃），3～4 次，加等量甘油，于 -40℃ 或冻干避光保存。