过氧化物酶标记测定法检测细胞凋亡

原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

（一）试剂配制

1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml,pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。

4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29.96g和氯化钴0.238g。

5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。

6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml

7、0.05%二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg;PBS 10ml，pH7.4， 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。

8、0.5%甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。

9、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）

（二）实验步骤

1、标本预处理：

（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug/ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。

（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10%中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min.置乙醇：乙酸（2:1）的溶液中，于-20℃处理5min,去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 10⁷个/ml细胞于 4%中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50~100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min,然后按下述步骤2进行操作。

2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。

3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1~5min。

4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min.

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液，室温显色3~6min.

9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s.依同样方法再用100%正丁醇洗三次。

11、 用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

（三）注意事项

一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。