单细胞电泳法检测细胞凋亡

单细胞电泳法检测细胞凋亡的基本原理是细胞 DNA 链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核 DNA 由于分子量太大只能留在原位。

在中性条件下，DNA 片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA 发生解螺旋，损伤的 DNA 断链及片段被释放出来。由于这些 DNA 的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的 DNA 会离开核 DNA 向正极迁移形成「彗星」状图像，而未受损伤的 DNA 部分保持球形。

DNA 受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的 DNA 量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定 DNA 迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞 DNA 损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与 DNA 损伤效应的关系。

① 毛玻璃片

② 盖玻片

③ 计数板

④ 微量移液器吸头

⑤ 计数板

⑥ 相差倒置显微镜

⑦ 超净台（实验前紫外照射 30 min）

⑧ 离心机

⑨ CO₂ 孵箱

⑩ 荧光显微镜

⑪ 微量移液器

⑫ 水浴箱

⑬ 微波炉

⑭ 电泳仪

⑮ 电泳槽

⑯ 紫外灯

⑰ HeLa 细胞（或别的细胞）。

单细胞电泳法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：

A 样品处理，培养细胞，诱导凋亡，然后消化细胞，用 PBS 洗 2 次，并制成单细胞悬液，细胞浓度为 2 x 105 个/mL。

B 制备第一层胶，取 200 mL 0.5％常温熔点胶（45℃左右），加盖盖玻片，4℃固化10min。

C 制备第二层胶，轻轻地去除盖玻片；取 50 μl 1％ 低熔点胶（37 ℃）和50 μl 细胞悬液混匀后滴加在第一层胶上，加盖盖玻片，4℃ 固化 10 min。

D 制备第三层胶，小心去除盖玻片；取 75 μl 0.5％ 低熔点胶（37 ℃）滴加在第二层胶上，加盖盖玻片，4 ℃ 固化 10 min。

E 裂解，去掉盖玻片，将凝胶浸入预冷的碱性裂解液内（临用前加 10％ DMAO，1％ Triton X-100），4 ℃ 裂解 1 h。

F 取出玻片，用 PBS 缓冲液漂洗 3 次后置于水平电泳槽内，加入碱性的电泳缓冲液（pH10），没过玻片约 2～3 mm，放置 20 min。

G 电泳，以电压 25 V，电流 300 mA，电泳 20 min。

H 取出玻片，用 PBS（pH7.5）漂洗后，置于中和液 2 次，每次 15 min。

I 染色，胶上滴加 50 μl EB，加盖盖玻片，染色 10 min。

2 制胶过程中，每次自胶面移除盖玻片时，均需小心。

3 EB 为强诱变剂，有中度毒性。提示学生操作时应戴手套。EB 污染物及废弃液应单独存放。