单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤

单细胞凝胶电泳（single-cell gel eiectrophoresis，SCGE）又称慧星试验（comet assay）是一项较新的电泳方法。自1978年被Rydcbert B.等人成功地用于检验DNA单链断裂以来，经过不断的改进，已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中。

1、SCGE 的检测原理

尽管SCGE 技术己应用近20 年，但其检测单个细胞DNA 损伤的确切原理还不甚清楚。初步认为，各种因素诱发细胞DNA 损伤后会影响DNA 的高级结构，使其超螺旅松散。这种细胞经过实验中细胞原位裂解、DNA 解链等过程后，电泳时，损伤的DNA从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的DNA 部分保持球形，二者共同形成“慧星”。在一定范围内，“慧星”的长度（代表DNA迁移距离）和经荧光染色后“慧星”荧光强度（代表DNA 的量）与DNA 损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA 损伤。

2、SCGE 的操作方法

singh等人于1988 年描述的SCGE具体操作方法，被认为是经典的操作方法。其主要步骤有：将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价DNA 的损伤程度。改变相关的实验条件，可以检测DNA 不同类型的损伤，这是SCGE 的优势之一。如果在碱性溶液中溶解、解链、电泳，可以检测DNA单链断裂及碱不稳定损伤[；如果在冷溶解液中加入高浓度盐及其它变性剂，中性条件下溶解、解链、电泳，则可检测DNA 双链断裂。

3、SCGE 的主要计算指标

实验结束后，用荧光显微镜将“慧星”图像放大后拍摄下来进行分析。典型的DNA 损伤细胞荧光图像象慧星一样头尾分明。为了根据图像评价DNA的损伤程度，人们设计了一系列的计算指标。按其性质，大致可分为以下几类：

3.1 形状指标
　　这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否象慧星一样头尾分明将其分为慧星一样细胞和非慧星样细胞，计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计DNA 的损伤程度。这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。

3.2 距离指标
　　直接在显微镜下或在照片上测出慧星的一些长度数值，如尾长，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度，即“慧星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等，以评价DNA损伤程度。这些指标描述电泳中DNA泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系.

3.3 强度指标
　　Ostling等人最初用SCGE 技术检测射线对DNA损伤时用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA 的损伤。PoI1er 等人用“慧星”尾部总荧光强度同“慧星”头部总荧光强度的比值来表示DNA 的损伤程度。新近有报道根据“ 星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为0、1、2、3、4，将100 个细胞的分值加在一起表示DNA 的损伤程度，并证明该数值与总慧星长度有较好的相关性。这些指标都不同程度地反映了电泳中泳动DNA 的量。

3.4 “矩”类指标
　　为反映DNA 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面，有实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA 损伤程度明显增加而尾长基本不变。为将二者结合起来，更全面反映DNA 损伤程度，Olive 等人于1990 年首次描述了“尾矩”（tail moment ，TM ）的概念，定义为尾部DNA 占总DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积。作者用实验证实该指标比上述其它指标都优越，很快就被广泛接受。

定义TM 时将“慧星”尾部当作一个整体考虑，将头、尾部中心间距当作损伤DNA 的平均迁移距离。事实上尾部DNA 由不同DNA片段组成，不同片段迁移距离不同，即尾部DNA 的分布并不均匀。于是，Kent 等人提出“慧星矩”（comet moment ，CM）的概念。以“慧星”头部中心点为零点，沿电泳方向将“慧星”按一定的间隔分成若干个区域（80 个即可），分别测定每个区域的荧光强度（Di，代表该区域DNA 量）、该区域中心距零点的距离（Xi）、“慧星”总荧光强皮（Dt，代表总DNA 量），则CM 定义为∑ Di · Xi / Dt。实验表明，损伤因素作用剂量较大时，CM 与作用剂量间的相关性比TM 更为密切。近年来该指标也有所应用。
　　与此类似，如果预先设置一定的阈值将“慧星”头尾分开，将尾部分成若干区域，以各区域面积Si 和平均荧光强度Di 的乘积表示该区域DNA的量，以头尾部总面积（Sn 、St）与头、尾部总荧光强度（Dh 、Di）的乘积表示头、尾部的DNA 量，CM 就可变化为“尾部惰性”（tail interia，TI），表示为∑ Si · Di · Xi2/ （Sh · Dh + si · Di ）（xi 为区域中心到头部中心的距离）。作者通过比较认为在描述环磷酰胺处理后人外周血淋巴细胞DNA 损伤时，各种指标中TI 值的灵敏度是最高的。TI值必须借助精密仪器和复杂的软件才可得出,日前应用很少。

4、SCGE 的应用前景

检测外界因素对DNA 的损伤，SCGE 的检测结果同其它检测方法如程序外DNA 合成（UDS）等结果相关较好，而且SCCE能反映细胞群体中不同类型细胞对作用因素的不同反应，而不仅仅是群体细胞的平均效应水平，为确定遗传毒性因素的靶细胞提供了可能，也可用于肿瘤放、化疗抗性细胞的检出，为疗效评估和预后监测提供依据，同时该法方便易行，无需要求细胞处于生长状态，也无需同位素标记，其应用潜力是巨大的。但由于其理论基础不够明确，各实验室的操作方法差异极大，包括溶解液、电泳波的配方、溶解时间、电泳参数、DNA结合荧光染料的选择都远远没有标准化。评价各实验室结果也没有统一的标准，因此SCGE 有待于进一步的改进和完善。