单细胞凝胶电泳实验

细胞 DNA 链断裂时，DNA 的超螺旋结构受到破坏，在中性条件时，DNA 片段可进入凝胶发生迁移，而在碱处理和碱性电解质的作用下，DNA 发生解螺旋，损伤的 DNA 断链及片段被释放出来，由于这些 DNA 的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核 DNA 向阳极移动，形成彗星状的拖尾图像，而未损伤的 DNA 部分停留在原位，染色后成圆形荧光团。

评价单个细胞的 DNA 损伤（各种因素的生物反应、肿瘤的研究治疗预测）。

【试剂】低熔点琼脂糖、正常熔点琼脂糖

PBS、TBE（5X）、溴化乙锭（EB）

Tris-HCl 溶液、RIPA 细胞裂解液

载玻片、盖玻片

【设备】荧光显微镜、核酸电泳仪

1、单细胞悬液制备

用胰酶将细胞消化至离心管中并进行细胞计数，用 PBS 调节细胞密度至 10⁵~10⁶ 个/ml。

2、制胶

第一层使用 80 μl 0.5% 正常熔点琼脂糖滴到预热的载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第二层是低熔点琼脂糖与细胞的混合液，取 10 μl 含 10000 个细胞的 PBS 和 75 μl 0.5% 低熔点琼脂糖在 37 ℃ 混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的低熔点琼脂糖滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第三层胶制备同第一层胶一致，盖上盖玻片。

3、裂解

移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的 RIPA 细胞裂解液中至少裂解 2.5 h（尽量使每张玻片裂解时间相同）。此步骤的目的是裂解液由去垢剂及高盐溶液组成，除去溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA 等，仅存留核骨架。

4、解旋和电泳

细胞裂解后，取出载玻片，用 PBS 冲洗 2 次，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入 1XTBE 电泳缓冲液，覆胶面 0.25 cm，碱解旋 20 min，4 ℃ 冰箱中电泳 25~30 min，电压 25 V。

5、染色

将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用 Tris-HCl（pH 7.5）中和 15 min。然后每片载玻片上滴加 50 μl 30 μg/mL 的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色 20 min，即可观察。

6、镜检核图像分析

EB 染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。

1、细胞消化不彻底，没有得到单个细胞，多个细胞发生粘连。

2、尾巴形状不完全或者发生扭曲。

3、裂解液处理是本实验的关键，裂解液要澄清且完全溶解，裂解不彻底要延长裂解时间或考虑使用强裂解液。

4、溴化乙锭是剧毒物质，需做好防护，可考虑用其他核酸染料替代。

问题1：细胞消化不彻底，没有得到单个细胞，多个细胞发生粘连。

答：细胞消化过程在孵箱中进行消化，可以用移液枪轻轻吹吸。

问题2：尾巴不完整或者发生扭曲。

答：制胶过程细致小心，不要产生气泡、胶面平整。剥胶过程小心细致。电泳保持在低电压且电压平稳，在 4 ℃ 冰箱里电泳。