🔥 激光微辐射诱导 DNA 损伤

基因组 DNA 容易受到内源性和外源性因素的损害，激光微辐射穿过细胞核迅速产生局部染色质相关 DNA 损伤，激光的微辐射可以诱导多种类型的 DNA 损伤，包括双链断裂（DSB）、单链断裂（SSB）和氧化碱基。

分析活细胞中的修复蛋白募集，DNA 修复的影响因素。

活细胞显微镜兼容培养皿或培养皿、贴壁细胞系、CO₂ 对照、5′-碘-2-脱氧尿苷（IdU）、Hoechst 33342、4% 甲醛、PBS、封闭溶液、Triton X-100、鼠标抗 γH2AX、小鼠 IgG（H + L）二抗、牛血清白蛋白（BSA）、吐温 20、细胞培养箱；另外, 本实验的共聚焦显微镜应配备至少两个激光器，355 nm 或 405 nm 激光器用于微照射，另一个（例如 488 或 560 nm）用于成像。显微镜应配备一个培养室，用于控制温度、CO₂ 和湿度。

1. 细胞培养：在开始微辐照实验前 2~3 天，在培养皿中接种细胞，细胞直接生长在 35 mm 圆形成像皿上。（通常，0.5~1 × 10⁶ 细胞足以用于大多数多因素研究）

2. 在照射之前需要使用光敏剂进行预处理， 例如卤代核苷酸类似物 [溴脱氧尿苷（BrdU），5′-碘-2-脱氧尿苷（IdU）] 或与被检查细胞的 DNA 小凹槽结合的染料（Hoechst 33258， Hoechst 33342）， 以允许诱导 DSB 所需的能量吸收。用 10 μM 溴脱氧尿苷（BrdU）孵育细胞至少 24 小时或者用 10 μg/ml Hoechst33342 对细胞敏化 10 分钟，在加入 Hoechst 后约 60 分钟即可使用。

3. 向细胞中加入预热的 CO₂ 调节活细胞培养基， 其中补充有 10%FBS 和不含酚红的抗生素， 以尽量减少自发荧光。

4. 微辐射设置：选择用于 DNA 损伤诱导的辐射激光（355 nm 或 405 nm）， 并以 ms 为单位设置曝光时间（对于 355 nm 激光，创建 SSB 的曝光时间（总共 150 ms）， 或 DSB（总共 250 ms）DNA 损伤。这将分别导致大约 6~12 次（对于 DSB）或 5~8 次（对于 SSB）线/帧（如果使用其他形状）扫描，以诱导 DNA 损伤。通常， 对于 60×物镜，直线会在直线长度上产生宽度为 0.2~0.5 μm 的损伤。

5. 活细胞成像：在微照射之前和之后，以 2 秒的时间间隔记录一个中 Z 截面的共聚焦图像系列。

6. 所需蛋白质的免疫检测

（1）将细胞培养室从显微镜中取出，在 37 ℃ 的潮湿大气中孵育细胞， 其中含有 5% CO2，  时间为 5~10 分钟。孵化后，用 0.5 mL 的 PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄ 和 2 mM KH₂PO₄）清洗细胞， 并在室温下在 PBS 中用 0.5 mL 的 4% 甲醛 固定 10 分钟；

（2）用 PBS 清洗细胞一次，然后用 50 mM NH₄Cl 清洗它们，以清除残留的甲醛；

（3）用 0.5% Triton X-100 在 PBS 中渗透 5 分钟；

（4）在封闭溶液（5% FBS、3% BSA、PBS 中 0.05% Triton X-100）将样品孵育 40~60 分钟；

（5）PBS 清洗细胞一次；

（6）加入一抗，例如在封闭缓冲液中稀释的小鼠抗 γH₂ AX， 并在 4 ℃ 下孵育过夜；

（7）在 3×封闭溶液 中洗涤 5 分钟；

（8）加入二抗，例如驴抗小鼠 IgG（H+L）二抗，  Alexa Fluor® 488 在 4% BSA/PBS 中稀释，并在室温下孵育 1 小时；

（9）在 3×封闭溶液中洗涤 5 分钟；

（10）加入新鲜 PBS 并储存在 4 ℃。

1. 研究人员需要考虑激光参数-波长、脉冲长度、脉冲频率、显微镜/激光系统的可变「变焦」、曝光时间和能量 ， 在很大程度上影响光束诱导的病变类型和数量， 从而决定细胞反应。

2. 应特别注意处理 Hoechst（一种 DNA 插入剂）和甲醛（皮肤接触和吸入具有中度毒性）， 工作时应在通风良好的区域或烟气罩内进行。

（1）细胞看起来不健康，可能是细胞的初始状态不好，也可能是激光的强度过强，过度 DNA 损伤会使细胞凋亡；

（2）细胞在图像采集过程中移动，细胞在图像采集过程中改变焦点；

（3）激光微照射时未观察到蛋白质募集，改变激光参数重新实验。