琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡（基于细胞核DNA变化检测细胞凋亡）

琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡的基本原理是凋亡出现时，细胞内源性的核酸内切酶被激活，将染色质 DNA 自核小体间降解，形成相差 180～200 bp的大小不等的寡核苷酸片段。

提取凋亡组织或细胞的 DNA，经琼脂糖凝胶电泳，分离不同长度的 DNA 片段，再经 EB 染色，紫外灯下观察，可见特征性的梯状条带（ladder）。

器材：

① 500 mL 的锥形瓶

② 1.5 mL Eppendorf 管

③ 移液器吸头

④ 10 mL 吸管

⑤ 吸管橡皮球

⑥ 水浴箱

⑦ 微波炉

⑧ 离心机

⑨ 电泳仪

⑩ 电泳槽

⑪ 紫外灯

⑫ 微量移液器

⑬ HeLa 细胞（或别的细胞）。

试剂：

① 凋亡诱导剂（根据情况自定）

② 消化液（0.02％ EDTA）

③ PBS

④ 裂解液

（NaCl（100 mmol/L，pH8.0），Tris-Cl（10 mmol/L），EDTA（25 mmol/L，pH8.0)，SDS（5 g/L））

⑤ 蛋白酶 K（20 mg/mL）

⑥ RNA 酶（10 mg/mL）

⑦ 苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）

⑧ 3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）

⑨ 100％ 乙醇

⑩ 70％ 乙醇

⑪ TE 缓冲液

⑫ 电泳缓冲液（TAE）

⑬ 琼脂糖

⑭ EB（10 mg/mL）

⑮ 6 x 上样缓冲液

琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：

A 将 5 x 10⁶ 个已诱导凋亡的细胞收集至 1.5 mL Eppendorf 管中，600 r/min 离心 5 min，弃上清液。

B 冷 PBS（4 ℃）重悬细胞，1000 r/min 离心，弃上清液。

C 加入 497.5 μL 裂解液、2.5 μL 蛋白酶 K，重悬细胞。56 ℃ 水浴 3 h（或 37 ℃ 过夜），期间轻摇几次。

D 加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（500 μL），轻播 5 min，20000 r/min 离心 5 min，将水相移至一新 1.5 mL Eppendorf 管中。重复抽提一次。

E 加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L），2.5 倍体积的 100％ 乙醇，上下颠倒、混匀，冰浴 10～15 min。20000 r/min 离心 10 min 沉淀DNA，弃上清。

F 70％ 乙醇洗涤，晾干或真空抽干。

G 加入 TE 缓冲液 30～50 μL、RNA 酶 5 μL，37 ℃ 水浴 30～60 min［可重复步骤（4）～（6），以去除 RNA 酶］。

1 苯酚有强腐蚀性，能引起烧伤。氯仿有致癌作用，对皮肤、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激性。所以苯酚-氯仿-异戊醇相关的操作应戴手套、穿白大衣，在化学通风橱内操作。其废弃物应有专门的容器。