原位末端标记技术检测细胞凋亡

一、DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移（ISNT）
1．切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化。
2．将切片组织浸入2×SSC液中，80℃，20min，然后蒸馏水冲尽。
3．0.5％胃蛋白酶（pH2.0）37℃消化0～20min，PBS洗尽。
4．用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A，5min。缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2, 10mmol/L β-巯基乙醇，0.005％BSA，pH7.5。
5．弃去缓冲液A，滴加标记液约50μl，25℃温育1h。标记反应液：0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow大片段。
6．PBS漂洗2次，各3min。
7．内源酶阻断剂阻断15min。
8．PBS洗2次，各3min。
9．滴加HRP-avidin覆盖组织，室温下30min。
10．PBS洗2次，各3min。
11．DAB-H2O2显色约5min。
12．流水冲洗后，苏木素复染1min。常规脱水，透明，封片。
13．阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液，余同。

二、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）
1．切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行。
2．3％的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。
3．0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
4．切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
5．0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
6．蛋白酶K或胃蛋白酶消化0～20min。
7．0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
8．TdT缓冲液孵育10min。
9．TdT反应液37℃孵育1h。
10． 切片浸泡在2×SSC溶液10min，以终止反应。
11． 0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
12． 链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。
13． 0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
14． 0.04％的DAB显色5～10min，镜下控制时间。
15． 苏木素复染3～5min，常规复水，透明和封片。