【求助】斑马鱼原位细胞凋亡检测怎么做啊？

求助高人啊，我想用斑马鱼整体胚胎检测其细胞凋亡情况，选用的Roche的in situ cell death detection kit, POD. 按照其中的贴壁细胞或细胞涂片的方法做了两遍，可是连阳性对照都没有信号。后来查找到一篇论文中的方法，如下：
a，收集胚胎后用PBS清洗，转移到1.5ml的EP管内，4%多聚甲醛PBS固定过
夜
b，用PBS配制 25%50%75%的梯度酒精，每次5min将胚胎梯度脱水。
c，用-20度预冷的丙酮冷冻固定10分钟
d，PBS清洗 10minX2
e，用新鲜配制的通透液(含0.1%的Triton X-100和0.1%的柠檬酸钠溶液)
室温通透15min。
f，PBS清洗 10minX2
g. 阳性对照组加入DNase I 40ul(1u/ul)，37度孵育15min
h. PBS清洗 10minX2
i. Roehe试剂盒中的的TUNEL反应缓冲液(含FITC标记的dUTP)和脱氧核糖
核酸末端转移酶在冰上混合后加入。
j. 4度孵育过夜后放37度30min
k. PBS清洗终止反应，荧光显微镜观察。
可是还是连阳性对照都没有信号。
请问，哪位做过，指点一下吧，谢谢。
或者发到我的邮箱：weiwangsky@hotmail.com

首先，我不是高人没有搞过凋亡研究。

不过，我提醒你一句，商业化的凋亡试剂盒一般都是针对特定阶段。例如，针对细胞膜变化、Caspase酶活性、针对线粒体状态等等。你首先应该看看你选择的POD试剂盒是否满足你的需求（比如凋亡处在什么阶段）。

另外，看看试剂盒的说明书，例如，有的提示：“有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。”导致TUNEL测定得不到结果。

我也做了这个实验，发现整个斑马鱼都是荧光氯

我觉得你的实验方法上没有问题，我也用过ROCHE的试剂盒，没有问题，就是用荧光感觉背景很深，整个胚胎都有荧光。