原位杂交（以斑马鱼为例）

固定

收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)

一. 原位杂交第一天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

2） 置换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟

3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次

4） 置换成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟

5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温

4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交

1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB＋取代HYB－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交

1）吸去预杂交的HYB＋，加上100ul已加入探针的HYB＋溶液（探针浓度约为1ng/ul）..

2）60℃ 温浴过夜。

注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

二. 原位杂交第二天

1.

1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

2.

1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。

2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。

3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。

三. 原位杂交第三天

1） 用1ml含10％热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。

2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟

3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。

4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色

5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。

6）4C冰箱保存。

原位杂交中溶液的配制：

PBS:
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 调PH值至7.4
抽滤，灭菌

4% 多聚甲醛：

多聚甲醛 40g
PBS 1L
加热持续搅拌至溶液澄清。-20℃保存

PBST：

PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

20XSSC:

Na3Citrate 2H2O 88.2g
NaCl 175.5g
DEPC H2O 至1L
抽滤，灭菌

SSCT：

SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

HYB-：

甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其终浓度为0.1%，-20c保存。

HYB ：

HYB- 20ml
yeast RNA 10mg
heparin 1mg。
-20℃保存。

MAB：

maleic acid 11.6g
NaCl 8.8g
用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.5
4℃保存

MABT

MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.

10% blocking reagent:
blocking reagent 8g
MAB 72ml

1：2：7溶液：

灭活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7
用时现配

Staining buffer：

Tris 12.1g
pH9.5
Mgcl 6H2O 10.2g,
Nacl 5.85g
Tween-20 1ml,
用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM