斑马鱼精子复苏技术

器材：

鱼缸、培养皿, 移液器、冰盒、勺匙 Eppendorf 管等。

试剂：

① Hanks 储液（高温灭菌后 4 ℃ 保存）

配制 Hanks 储液：

储液#1: 8.0 g NaCl、0.4 g KCl，溶于 100 mL 双蒸水；

储液#2: 0.358 g Na₂HPO₄ (无结晶水）、0.60 g KH₂PO₄，溶于 100 ml 双蒸水；

储液#4:0.72 g CaCl₂，溶于 50 ml 双蒸水；

储液#5: 1.23 g MgSO4·7H2O， 溶于 50 ml 双蒸水；

储液#6: 0.35 g NHCO₃，溶于 10 ml 双蒸水。

② Hanks 预混合液（按顺序混合 10.0 mL 储液#1、1.0 mL 储液#2、1.0 mL 储液#4、86.0 mL 双蒸水和 1.0 mL 储液#5、4 ℃ 冷藏保存）;

③ Hanks 液（：取 9.9 ml Hanks 预混合液，加入 0.1 mL 储液#6 即为 Hanks 液，4 ℃ 冷藏保存。分装在 1.5 ml 的 Eppendorf 管中，每管 100 μL，置于冰水浴待用。每管可用于复苏一份精子）。

斑马鱼精子复苏技术的基本过程可分为如下几步：

A. 斑马鱼的准备：粘子复苏前一天晚将雌伯和雄鱼各一条隔离放置于配鱼缸中。第二天早晨取走隔板，密切观察行两条鱼追尾几分钟后（注意要在雌鱼产卵之前），取出雌鱼，将全部雌鱼合并放入同一个鱼缸中备用；

B. 从液氮罐中取出需要复苏的精子样品，注意需两人操作，一个人提出冻存架，另一个人取出样品（冻存管）。用尖镊将一支毛细管从冻存管中夹出，交给提冻存架者用手捻融，同时尽快把其他样品（冻存管）放回冻存架，并将冻存架归位、盖上液氮罐；

C. 把融好的精子吹到置于冰水浴中、含有 Hanks 液的 Eppendorf 管中，用移液枪吹吸混匀，置于冰水浴中待用。此时捞出雌鱼，挤压雌鱼腹部获取卵子，用勺子刮下，移液枪吸取稀释的精子滴入勺中（卵上），用 1 ml 移液枪吸取 1 ml 鱼水，将勺中的卵与精子一起冲到培养皿中；

静置 1 分钟左右，待鱼卵外膜鼓起后再加鱼水至培养皿的一半，将培养皿（鱼卵）放置 28.5 ℃ 培养箱。30 分钟后即可观察受精情况。