斑马鱼应用实例
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迄今为止，文献报道的就有超过 65 个从斑马鱼上筛选出来的小分子（表 1）。这些筛选出来的小分子在斑马鱼上从胚胎形态到心脏和睡眠等都有不同的表型。其中一些是老药新用，一些则是刚刚发现的新型化合物。这里，我们重点关注那些在斑马鱼上发现的有希望揭露不同治疗方法的疾病相关的化合物。
新药研发
Prohema
Prohema 是前列腺素 E2（PGE2，PGE2 之所以能促进 HSC 的生产能力与 WNT 信号通路有关）的一个稳定的衍生物，目前处于临床 II 期，实验者为接受脐带血（UCB）移植的白血病或淋巴瘤的患者。起初，Prohema 之所以会被在斑马鱼上被筛选出来是因为它会增加或减少造血干细胞（HSC）的数量。我们用自动原位杂交法给胚胎主动脉-性腺-中肾区的 HSC 染色，进而筛选出提高或降低 HSC 数量的药物。Prohema 的治疗潜力最早在成年斑马鱼被展示，它增强了斑马鱼在亚致死照射后骨髓恢复的速率。在小鼠中，全骨髓暴露于 Prohema 的体外能形成更多脾集落形成单位。同样，Prohema 处理的全骨髓能更有效地重建造血系统，并制造出 HSC。
对于人类接受 HSC 移植作为治疗白血病或淋巴瘤的手段，UCB 已成为可移植的 HSC 的重要来源。然而，存在于标准 UCB 样品中的 HSC 个数通常不足以治疗成人，因此，Prohema 提高 HSC 数量和其再植能力的作用就变得十分重要。
Dorsomorphin
Dorsomorphin 及其衍生物是骨形态发生蛋白（BMP）受体的抑制剂：在人类中被称为活化素受体样激酶 2（ALK2，也被称为 ACVR1），在斑马鱼则是 Alk8（也称为 Acvr1l）。这些化合物目前正在开发中，用于治疗进行性肌肉骨化症（Fibrodysplasia ossificans progressiva，FOP）和炎症性贫血（图 1）。Dorsomorphin 是在斑马鱼上找寻能影响早期胚胎发育基础身体和器官的形成的物质时被发现的。在筛选一个有几千个化合物的化合物库时发现了一个吡唑并嘧啶化合物，经鉴定其会导致背部化——即背部组织的过度扩增代替的腹侧组织。经它处理的斑马鱼胚胎发育后表现为尾部断裂或缺失。之后，这个吡唑并嘧啶被命名为 dorsomorphin，以此反映其背部化活性。
背部化吡唑并嘧啶此前被描述为 AMP 活化的蛋白激酶的抑制剂（AMPK），但其他的 AMPK 却不能复制其在斑马鱼胚胎的表型，这表明了 AMPK 不是背部化的靶点。相反，dorsomorphin 处理过的动物是很难与一种隐藏在 Alk8 突变中的叫做 lost‑a‑fin 的遗传突变疾病相区分。这种表型相似性表明，dorsomorphin 可能抑制了斑马鱼的 Alk8，对应到人则是 ALK2——这一假设已经被证实。
极度活跃的 BMP 信号通路会引起多种疾病，包括 FOP 和炎症性贫血。作为 BMP 通路的第一小分子抑制剂，dorsomorphin 衍生物 LDN-193189 已在啮齿动物模型上被证明是有效的治疗 FOP 的和炎症性贫血。此外，它已在哺乳动物模型上被证明是有效的治疗其他 BMP 相关疾病，包括动脉钙化和炎性肠病的药物。由于 BMP 抑制剂有着治疗此类疾病的良好效果，dorsomorphin 和临床前开发衍生品已经通过了美国卫生国家机构的 TRND（重点罕见或易忽略疾病治疗）和 BrIDGs（弥补干预疗法开发鸿沟）方案，将用于治疗 FOP 和早期临床试验中的炎症性贫血。
PROTO‑1
氨基糖苷类抗生素可以通过杀死听细胞导致听力损伤，PROTO-1 及其结构上类似的苯并噻吩甲酰胺类是目前正在被开发用于预防抗生素引起的听力损伤。用斑马鱼筛选了 10960 个化合物后终于确定了一些能保护听细胞免受氨基糖苷类的伤害的化合物，被认为是斑马鱼强有力的耳保护剂。PROTO-1 的制作现已被授权给致力于开发苯并噻吩甲酰胺类的耳保护剂的 Oricula 治疗公司。Oricula 表示，先导物优化产生的类似物与 PROTO-1 相比效能超过 100 倍，且更安全。
老药新用
除了发现具有治疗潜力的新的化合物，斑马鱼已经被用于鉴定一些现有的药物, 看看是否能鉴定出新的用途。利用已有药物进行筛选可以提供一种更容易通过临床调查，因为它们已经被批准, 至少已经通过了药代动力学分析和安全测试
cox 抑制剂
通过转入人急性髓性白血病 (AML) 致癌基因 AML1-ETO 建立斑马鱼 AML 模型, 其骨髓原始细胞的累积与患者十分相似。明显的白血病相似表型和白血病形成时的 WNT–β-catenin 信号，都可以从已有药物中鉴定出环氧化酶（COX）抑制剂。在老鼠中实验也证明 WNT–β-catenin 信号是白血病干细胞自我更新所必须的。更甚者，用 COX 抑制剂处理小鼠 AML 模型后发现其成功抑制了白血病癌细胞的转移和增殖。又因为 COX 抑制剂已被批准使用且在人体身上反应较好，因此，此药可能将会快速通过 1 期直接进入临床试验。
糖皮质激素
kcnh2 基因沉默后建立斑马鱼 QT 间期延长综合症模型，具有动作电位延长和 2:1 房室传导阻滞的特征。通过表型和相关通路的鉴定，用斑马鱼模型从现有的药物中识别到糖皮质激素氟氢缩松为 LQT 综合征治疗药物。和哺乳动物相比有更高的分辨率，证明葡糖类皮质激素能缩短 LQT 心脏的动作电位持续时间。现在美国马萨诸塞州总医院关于糖皮质激素地塞米松在 LQT 综合征患者的临床试验已经开始了。早期结果与地塞米松可能会缩短在人类患者的 QT 间隔的假设是一致的。
确定作用机制上的挑战
与其他基于表型的小分子筛选相比，确定斑马鱼发现的小分子的作用机制（MOA）仍是最显著的障碍。虽然具有挑战性，MOA 研究仍是基于表型的药物筛选中最有价值的部分，因为他们往往是意想不到的或革命性的巨大新发现。其它研究表明有大量的计算机技术、生物和遗传技术都可以用于斑马鱼发现的小分子的机制研究中，并且已有多个成功的示例。例如，在 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T -ALL）斑马鱼模型，亲和色谱法联用质谱层析法被用来鉴定奋乃静（一种杀死 MYC 过度表达胸腺细胞的抗精神病药）的作用靶点——蛋白磷酸酶 2A（PP2A）的 Aα亚基。类似地，亲和层析用于证明线粒体苹果酸脱氢酶是 visnagin 的靶点，visnagin 是在斑马鱼心脏疾病药物筛选中筛出的心脏保护化合物。
除了通用的方法来确定药物作用机制，也有用斑马鱼来鉴定机制的，其中最有效的方法就是斑马鱼基因沉默结合斑马鱼表型。药物引起的表型和遗传突变引起的表型之间的相似性往往能为识别提供线索，进而确定药物靶点（图 2）。例如上述的 dorsomorphin，lost‑a‑fin 突变的表型就证明了 BMP 通路就是 dorsomorphin 的作用靶点。胚胎时用 dorsomorphin 处理的斑马鱼丢失他们的腹侧的尾鳍——这样一个不寻常的表型，却与 lost‑a‑fin 突变后的表型几乎完全一致，说明 dorsomorphin 抑制 ALK2，由是突变破坏了蛋白质。
有一个更近的例子，斑马鱼胚胎发育药物筛选实验中发现 kalihinol F 会造成几个独特的发育缺陷，包括脊索起伏和色素沉着、造血系统和神经发育上的缺陷。而苯氧类化合物被确定会造成相似的缺陷，一种铜转运 ATP 酶 atp7a 功能被破坏的斑马鱼突变体。此相似的表型充分说明了其相关性，事实上，外源铜可以拯救 kalihinol F - 诱导的斑马鱼发育缺陷疾病，而 kalihinol F 能够抢救铜中毒的斑马鱼胚胎和哺乳动物细胞。
应当指出的是，这种通过多维表型匹配来确定机制的方法还可以用于那些起初不是由斑马鱼发现的化合物上。就像烟曲霉素，一种抗血管生成的自然产物，被发现已经超过 60 年，而它的靶点蛋氨酸氨肽酶-2（MetAP-2）被发现不超过 15 年。用 fumagillin 处理过的斑马鱼有一个十分特别的原肠胚形成表型，而这个表型与非典型的 Wnt5 突变的表型十分相似，说明 fumagillin 造成的 MetAP-2 抑制最终破坏了非经典 Wnt 信号通路下游受体的结合。
其他药物研究中的斑马鱼应用
虽然大部分在斑马鱼化学生物学学术努力一直专注于小分子的发现，但这绝不是斑马鱼在促进药物发现和发展中唯一的选择。事实上，工业中常将斑马鱼用于毒理学实验，大多数大型制药企业都会公布一些使用斑马鱼的毒理学数据。值得指出的是，斑马鱼的毒理学作用往往与哺乳动物的不同。由于成本低又省力，斑马鱼可以更早地用于临床前开发。例如，可以高通量筛选数百或数千个化合物，也可以在早期阶段消除候选毒性化合物，进一步优先实验并提高命中率，节省大量之前会被浪费的资源。
正如前面所说，斑马鱼已被证明是用于预测几种类型的药物毒性的良好模型（ 图 3）。比如，心脏毒性，在斑马鱼和人之间是高度保守的。药物的系统研究表明，导致人体QT 间期延长的药物 >95％ 在斑马鱼上也有类似的效果。类似地还有肝毒性，肾毒性和生殖毒性，其中所有的在临床前模型哺乳动物或人类上鉴定过的已知毒物在斑马鱼上都有类似的效果。然而，这还需要付出相当大的努力，进一步评估各个毒性，以建立斑马鱼和人毒理学之间的规范。
斑马鱼的未来
基因工程
转录激活因子样效应核酸酶（TALENS）和 CRISPR-CAS 的出现极大地改变了以斑马鱼为基础的研究。在过去 2 年里，CRISPR-CAS 技术使靶基因功能丧失或获得性快速突变变成了可能，并首次使在斑马鱼上重新创建人类疾病的等位基因成为了可能，这对药物发现的潜在影响无疑是巨大的。随着大量的人类疾病相关基因的发现，如何将这些理论转化为治疗方法逐渐成为重点。由于斑马鱼突变体制作简单，表型突出，与啮齿动物相比，斑马鱼很可能是用于测试候选疾病基因的流行选择。随着基因编辑技术的不断改进，在斑马鱼上重现几十或几百种人类基因突变，随后对其表型进行快速评估，并用于筛选疾病相关的化学抑制剂
行为仪筛选新型神经活性药物
神经系统疾病，可以说是药物筛选中最难的部分。尽管对于神经系统疾病的患病，通常有几个有效的药理学疗法。开发新的中枢神经系统（CNS）药物是缓慢的，昂贵的，充满了失败。挑战包括现在只有少数几个神经疾病的靶点被发现和难以创建合适的 CNS 疾病模型。精神病的表现，如抑郁症和精神病又难以在动物中表现出来，神经变性终点往往发展缓慢且难以量化。
斑马鱼行为筛选模型提供了一个有趣的中枢神经系统药物发现替代方法。斑马鱼具备丰富的行为，包括简单的刺激-反应行为和更复杂的行为，如学习和睡眠能力，这些行为可以在 96 孔板中研究。虽然斑马鱼和人的行为不同，但根本的回路、细胞和受体是相似的。因此，通过斑马鱼来筛选相似回路上的作用药物就变成了可能。例如，它可能难以分辨斑马鱼是否有精神分裂症或精神分裂症，但可以分辨出疾病相关的的蛋白和细胞。抗精神病药物会对这些蛋白质和细胞进行调节，进而引起特定和独特的行为改变，确定合适的化合物。研究表明，在斑马鱼的行为试验中，某些公认的神经活性药物能产生独特的和可再现的行为特征，建立相应的行为学模型可以高通量筛选出具有类似行为效应的新的化合物（图 4）。或者使用基因工程技术在斑马鱼上重建人类疾病机相关的突变，突变后筛选抑制异常行为并能恢复正常行为的化合物。
未解决的问题和存在的挑战
斑马鱼模型虽然拥有很大的前景，但也面临着巨大的挑战。其中最显着的问题是药物暴露的控制和定量。虽然很容易控制在水中的药物的暴露浓度，但难以预测多少药物将被斑马鱼吸收。有些药物似乎吸收不良，而另采取了一些容易的方法。药物水平通常在血清或哺乳动物模型组织中直接测量，但这些测量更具挑战性，使斑马鱼在高通量上得应用造成了阻碍。虽然 logP 等一些物理化学属性也能预测斑马鱼的药物吸收，但这仍然是不完善的，一旦此方法被改进，无疑会使斑马鱼在药物筛选上的应用更加成熟。
当然，其他一些挑战也依然存在。例如斑马鱼的表型分析，尤其是复杂的表型，例如动物的自然变异等，当然，这个可以通过建立许多不同的研究小组进行（表 1）。另一个挑战是生产足够的斑马鱼，实现真正的大规模高通量筛选。改进的大规模生产和处理斑马鱼胚胎的方法将第非常有益的。
【环特生物】中国首家斑马鱼生物技术服务公司（CRO），面向医药、化工、食品、环境等领域，提供药物研发、安全性评价、毒理学研究和生物医学研究等专业服务。
