高通量整体原位杂交检测环境干扰斑马鱼 胚胎组织特异性基因表达改变实验

一、材料

所有溶液必须用无 RNase 的试剂和 DEPC 处理的蒸馏水配成。和胚胎接触的仪器、

工具和试剂需采取 RNase 失 活 处 理（见 注 释 1)。

1 仪器

（1）制作原位杂交篮的加热板（ heat block)。

（2）原位杂交篮：去 掉 1.5 m L 离心管尖头部分或者其他圆柱形物体，将一片精细尼

龙网和离心管剩余部分利用加热板低温熔化粘连。去除尼龙网格多余部分。注

意不要过热，否则会熔化尼龙网。

（3）六 孔 板（BectonDickinson, cat.no.1146)。

（4）用于在格孔间移动原位杂交篮的平头镊子。

（5）用于移动胚胎的玻璃移液管。

2 地 高 辛（Digoxigenin， DIG) 探针的制备

（1）f X g 包含目的基因的纯化的线性质粒（见注释 2)。

（2）IOXDIG 标记混合物： 1 0 mmol/L A T P ， 1 0 mmol/L C T P ， IOmmolZLGTP,6. 5 mmol/L UTP, 3. 3 mmol/L DIG-11UTP (Roche)0

（3）转录缓冲液和牛血清白蛋白（BSA) /二硫苏糖醇（DTT; 同酶一起)。

（4）苯酚-氯仿-异戊醇（PCI) : 苯酚-氯仿-异戊醇按 25 : 24 : 1 比例混合， 4°C 黑暗储存。

（5）氯仿-异 戊 醇（CIA) : 氯仿-异戊醇按 24 : 1 比例混合，一 20°C 储存。

3 胚胎准备

（1）4 % PFA-PBS 溶液： 8 0 m L 含 4 % 多聚甲醛的 1XPBS。缓慢加人 NaOH 至多聚甲醛完全溶解。用 H Cl 调 节 p H 至 7. 2。加 蒸 馏 水（dH20 ) 至 100 mL。短期储存于 4°C (1〜2 周），长期储存于_20°C d

（2）5XPBS: 40 g NaCl， I g KC1， 14.4 g Na2 HPO4, 2. 4 g KH2PO4, 加入 DEPC处理过的水至 800 mL, 用 H Cl 调 节 pH 至 7. 4。加入 DEPC 处理过的水至终体积 I L。用时稀释至 1XPBS。

4 整体原位杂交

（1）PBSTween (PBST): 0.1% Tween-20， 1XPBS。

（2）蛋白酶 1<： (50 网 /11^): 用水溶解 5 〇 11^蛋 白 酶 1^粉 末 ，分装并储存于一 20°〇。

（3）甘氨酸溶液：用 IX P B S 配 制 2. 7 mm 〇 l/L 甘氨酸。

（4）5X 预 吸 收 的 anti-DIG 抗体溶液： anti-DIG 抗 体（Roche) 1 : 1 0 0 0 比例稀释，2 % 小牛血清， 2 mg/mL BSA 和 在 IX P B S T 中固 定 的 20〜5 0 个 胚 胎 ，溶液室温 放 置 I h 或 者 4°C 过夜。储存 于 4°C ，使用时用 PBST 稀 释 至 I X (见 注 释 3)。

（5）20XSSC: 3 mol/LNaCl， 0. 3 mol L 柠檬酸钠， pH7。高压灭菌。

（6）杂交液： 5 0 % 甲醛， 5 X SSC， 0 . 1 % Tween-20， 50 pg/mL 肝 素 ， 100 ptgZmL

酵 母 tRNA， 9 mmol/L 柠檬酸，储存于一 20。。。

（7）杂 交 后 混 合 液（post-hyb mix): 5 0 % 甲醒， 5 XSSC， 0 . 1 % Tween-20， 50 fig/m L 肝素， 9 111111 〇 1,/1 柠 檬 酸 ，储存于 20℃。

（8）100 ng 探 针（1〜2 p L 悬浮探针）（ 见 3.1)。

（9）封闭液： 2 % 小牛血清， 2 mg/m L 的 BSA, 用 PBST 加至终体积。

（10）染色缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCl， pH 9. 5 ， 50 mmol/L MgCl2， 100 mmol/L NaCl， 0 •1 % Tween-20, 0. 4 mmol/L 左 旋 咪 唑（Ievamisol) (见注释 4)。

（11）NBT 储 存 液 ： 7 0 mg/mL 氮 蓝 四 唑（nitrobluetetrazolium, NBT) 溶解于二甲 基 甲 醜 胺（dimethylformamide)， 4°C 避光保存。

（12）BOP 储存液： 5 0 mg/mL 对 甲 苯 胺 蓝（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸， 5-bromc^ - chlor⑴3-indolyl, BOP) 溶 于 7 0 % 二甲基甲酰胺中， 4°C 避 光 保 存（见注释 5)。

（13）胚胎保存液：含 0 . 0 2 5 % 叠氮 钠 的 1XPBS。

二、方法

1 制备 DIG 标记的 RNA 探针

（1）按照说明书选择适当的内切酶消化 10 邱质粒 DNA (包含目标序列）制 备 DNA模板。内切酶应在基因序列的 3’端酶切以合成反义探针，在 5’端酶切合成正义对 照 探 针（见 注 释 6)。

（2）模板可以通过商业化的纯化柱系统或者用等体积的 PCI 和 CIA 混合抽提。

（3）抽提的模板进一步用 1/10 体 积 的 3 mol/L 乙 酸 钠 和 2 倍 体 积 的 1 0 0 % 冰乙醇沉淀。

（4）轻柔振荡溶液后最大转速离心 30 min。

（5）D N A 沉 淀 用 7 5 % 冷乙醇洗涤，空气干燥，再 用 10 juL DEPC 水溶解。

（6）用分光光度计或者琼脂糖凝胶电泳配合标准物来定量模板的浓度。

（7）探针的合成需要通过以下反应，总体积不能超过 20 。探针合成反应包含 l Mg的线性 D N A 模 板 ， IX DIG 标 记 混 合 液 ， I X 转 录 缓 冲 液（同转录 酶 一 起 ），DTT 或 BSA (同转录酶一起）， 40 U RNasin (Promega)， 20〜50 U 的 RNA 聚合酶。根据所使用的 RNA 聚合酶选择合适的温度和时间进行孵育（一 般 I h )。

（8）再加入 20〜50 U RNA，聚合酶孵育 I h。

（9）加入 40 U 的 DNase ]；， 37°C 孵育 10 min (见注释 7)。

（10）加人终浓度为 0. 02 mol/L 的 EDTA， 0• 5 mol/L LiCl， 70% 乙醇 ， 一 8(TC 1〜2 h 或过夜，沉淀探针。

（11）14°C 最大转速离心 30 min 分离探针。

（12）99% 乙醇洗涤探针沉淀，空气干燥，再 溶 于 50 /xL 或 更 少 的 DEPC 水中，_80°C 储存。吸取 2 pL 在 EB 染色的琼脂糖凝胶上电泳检测探针质量。

2 斑马鱼胚胎制备

除非特别说明，所有的胚胎操作都在放置于六孔板的单孔中的自制小篮里进行（图D 。——个六孔板的单孔可以放置六个小篮，用平头镊子将小篮在含有不同孵育液的孔间转移
（1）4 % P F A 固定去除外膜的胚胎， 4°C 过夜。

（2）脱水前用 IX PBS 洗漆胚胎，一 20°C 储存于甲醇中。

（3）储存于甲醇中的胚胎在做原位杂交之前至少放过夜。胚胎在一 20°C 储存于甲醇中可放数年。

3 整体原位杂交

（1）选取胚胎，相继在以下溶液中孵育重新水化： 7 5% MeOH-25% PBS， 50%MeOH-50% PBS， 2 5% Me 〇 H-75% PBS 各 5 min; PBST 孵育 4 次，每次 5min。重新水化的胚胎可以用于原位杂交和制备预吸收的抗体溶液。制备预吸收的抗体的方法参照 2. 4. 4。

（2）24 h 或更老的实验胚胎在含蛋白酶 K (0. 1 网/mL) 的 PB ST 中处理预先决定的 时 间（见注释 9)。

（3）迅速用 PBST 洗涤胚胎，在含 2 mg/m L 甘氨酸的 PBST 中孵育 5 min。

（4）用 4 % PFA-PBS 固定胚胎 20 min，再 用 PBST 洗涤。

（5）用移液器将胚胎移至 I.5 mL 离心管中，在杂交缓冲液中 65°C 预杂交 I h。

（6）在加人 1〜2 /100 fzL 探针的新鲜杂交液中 65°C 杂交过夜。

（7）用移液器将胚胎移至自制小篮中。

（8）胚胎在下列溶液中 65°C 各孵育 10 min: .

7 5 % 染交后混合液-25% 2XSSC

5 0 % 染交后混合液-50% 2XSSC

2 5 % 染交后混合液-75% 2XSSC

100% 2X SSC

（9）胚胎在 60°(：， 0.2\33 〇中洗涤两遍共 30 111 丨 11 。然后胚胎在下列溶液中室温下

孵育各 5 min:

7 5 % 0. 2XSSC-25% PBST

5 0 % 0. 2XSSC-50% PBST

2 5 % 0. 2XSSC-75% PBST

100% PBST

4 染色和检测

（1）胚胎在封闭液中室温下孵育 1〜4 h, 然后在预吸收 anti-DIG 抗 体（1 : 5000) 中室温下孵育 3〜4 h。

（2）胚胎在室温下用 PBST 洗 6 次共 15 min 以去除多余抗体（见注释 10)。

（3）胚胎在室温下用染色缓冲液预孵育 5 min。

（4）在 含 0 •4 mmol/L N BT 和 0. 4 mmol/L BCIP 的染色缓冲液中进行染色反应。染色反应时间取决于探针和预期基因的表达量。应 每 15〜30 min 观察染色反应以确定适当的染色时间。在小篮中的胚胎可以用标准立体切割显微镜观察。染色过程应在黑暗中操作，尽量避免见光。胚胎置于染色混合液中时间越长，染色越浓；但是如果染色时间过长，背景会很强，这样就难以区别真正的染色和背景 ，特别是当被测基因的表达水平很低的时候（见注释 11)。

（5）当染色完成后，胚胎在室温下用 PBST 洗涤两遍共 15 min。

（6）再用 4 % P F A 在室温下固定 2 h 或 者 4°C 过夜。

（7）胚胎用 PBS 洗涤，并储存于含 0.025% 叠氮钠的 PBS 中， 4°C 下可长期保存。

5 自动化原位杂交

下面的自动化操作步骤使用的是 Intavis Bioanalytical Instruments AG (Koeln，Germany) 研发的 Insitu P ro 自动化原位杂交系统。在胚胎进入仪器前需经过重新水化和蛋白酶 K 处 理（见步骤 3. 3. 3)，染色也需人工操作（从步骤 3. 4.4 开始）。程序首先是在室温下（TO [OFF] ) 清洗仪器。然后胚胎先在 125 的杂交缓冲液（C) 中室温下孵育 20 min (步骤 5)，温度升至 65°C (T 2 [HIGH] ) 后在新鲜的在杂交液中孵育90 min。将探针加人胚胎中， 65°C 孵 育 M h (步骤 8)。胚胎再用 150 的溶液 D、 H、F、 E 各洗涤 20 min, 这些溶液中的 SSC 和杂交液浓度各不相同（步骤 9〜13)。温度再次降至室温（TO [OFF] ) 后 ，胚胎再用 150 的溶液 I、 J、 K 、 A 各洗涤 20 min。在120 的溶液 L (封闭液）中孵育 60 min 后 ，胚胎再在 120 的溶液 M (DIG 抗体)中孵育 4 h。用 150 从 的 溶 液 A (PBST) 洗潘胚胎 7 次各 20 min 后程序将等待用户指令（步骤 3 0 , 等 待 NTMT)。用户从仪器中取出胚胎，直接进人步骤 3. 4. 4。仪器在结束程序后自动清洗。此方案可以在 48 h 内处理 500 个胚胎。 Insitu Pro 系统使用的容器及其中的溶液具体标注如下（见注释 12):

A : PBST

B: 5 0 % 甲醇

C : 杂交缓冲液

D: 7 5 % 杂交缓冲液+ 2 5 % 2XSSC

E ： 0.2XSSC

F ： 2XSSC

H : 2 5 % 杂交缓冲液+ 7 5 % 2XSSC

I： 7 5 % 0. 2 XSSC+ 2 5 % PBST

J： 5 0 % 0.2XSSC+ 50% PBST

K ： 2 5 % 0. 2 XSSC+ 7 5 % PBST

L : 封闭液

M : DIG 抗体

探针： DIG 标 记 的 RNA 探针

程序编码如下：

6 原位杂交信号的定量

原位杂交信号的定量是通过数字光学显微镜和相对基本的图像分析软件实现的。对处理的胚胎拍摄数字图像并保存成图像分析软件识别的格式。为了保证数据的采集没有人为的偏见，』成像和分析应采用双盲法。此外，在图像采集前应保证所有的胚胎都处于相似的排列方式，以避免因视角的变化而导致图像获得的数据发生改变。因此，在拍摄前可将胚胎固定于铺了一层琼脂的培养皿上。用小镊子或者移液器在凝胶中挖小槽或者小洞 ，胚胎可以放在其中保证固定的方位。最后应用一致的光强，保证原位杂交信号的色彩值尽量在各个样本之间可以统一。获得胚胎的图像之后，图像可以使用任何一种图像分析软件包分析，包 括 AdobePhotoshop(www.adobe,com)、 NIH Image (http://rsb.info.nih.gov.nih-image)、Simpie PCKhttp ：//www.cimaging.net/ ) ^ ；Metamorph(http ： ‘^ oleculardevices.com/pages/software/metamorph.html)。所 有 这 些 软 件 都 能 测 定 各 种 图 像 参 数（面积、长度、密度等），而且大部分情况下都能将数据输出成可识别格式，例如电子表格等用于后续
分析。像素阈值技术被用于自动识别有原位杂交信号的细胞。在使用图像软件选择特定的 光 谱 颜 色（通 常 在 NBT/BCIP 染色中选择蓝色）后 ，软件本身就会根据所选像素确定测量值。图 2 显示的是暴露于氯化镉后的斑马鱼胚胎的分析结果。为了确定镉暴露是否对胚胎脑的发育造成影响，我们选择了一个仅在中脑和后脑分界的弥散区域表达的探针进行了原位杂交检测。通过分析 100 个对照和 100 个处理的胚胎，并测定了 成 表
达域的面积，我们发现镉暴露会导致该基因在这一组织内的表达显著增强。