PCR Array 简单实用的检测基因表达的高通量方法
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简介：什么是PCR芯片？
实时定量PCR是检测基因表达最灵敏，最可靠的方法。通过在试验过程中，实时监测荧光染料的信号变化，反映样品中的基因拷贝数。实时定量PCR线性范围广（能达到5个数量级），因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是，由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因此，每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。
通过简单的，经过优化的实时定量PCR体系，如SuperArray的RT2ProfilerTM PCR芯片，研究者可以同时研究大量基因，既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究，也可以作为验证芯片结果的方法。
为了获得理想的实验结果，PCR芯片面临以下挑战：高特异性，高灵敏度和可重复性。高灵敏度或低检出限，在样品的总RNA量少，基因表达量低的情况下，也能检测出目的基因。高特异性，扩增产物严格保证基因特异性，避免非特异性产物，如引物二聚体的产生。可重复性，通过标准化的反应体系和实验方法，使得多人多次重复实验均能获得可靠的基因定量结果。
PCR芯片实验操作步骤
采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程如图1所示：首先将RNA样品反转录为cDNA第一链，作为PCR模板；接着，将模板加入到反应体系（RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix）中。在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反应体系，进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值（Ct）。最后，采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性，可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照，可以检测PCR体系中是否存在DNA污染，或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。
图一 PCR芯片实验流程
PCR芯片的设计和所包含的基因
96孔模式的每种RT2Profiler PCR芯片，含有基因特异性引物，可用于研究84个与某种信号通路或者疾病相关的基因。此外，芯片中还有设置了3个检测实验质量的对照。图2为PCR芯片模式图。由于每种芯片都是根据特别的信号通路或者特定的应用范围设计的，研究者可以用它来研究自己感兴趣的一组基因，一个生物学通路或者某种疾病状态。PCR芯片所研究的基因范围相对集中，大大节省了在数据分析方面所花费的时间，相对更简洁针对性更强的信息也有利于接下来的更深入更准确的研究。因此，研究者使用PCR芯片，可以在更短的时间内得到更丰富的信息。此外，Superarray将相关基因设计在同一张PCR芯片内，为实验准备阶段也提供了方便。
图二 PCR芯片示意图
A1-G12孔包含了同一信号通路或者疾病的84个相关基因的引物（gene 1- gene 84）
H1-H5孔包含了5个看家基因（HK1-HK5），用于芯片数据的标准化。H6为基因组DNA参照（GDC），其中固定的引物能特异性的检测非转录的基因组DNA重复片段，从而检测样品中是否存在DNA污染。H7到H9是三个重复的孔，均为反转录参照（RTC），用于检测RT反应的效率。H10到H12是阳性PCR参照（PPC），反映了PCR反应的效率。这些孔中加入了人工合成的DNA序列和相应的引物对。两组重复的对照RTC和PPC也可以用于检测芯片间和芯片内的一致性。
预设计的信号通路特异性PCR芯片
96孔模式的RT2Profiler PCR芯片根据SuperArray的Pathway-Centric TM原理设计，将现有的重要信号通路研究进展与PCR芯片方法结合，是检测信号通路提供独特的研究工具。在设计PCR芯片时，Superarray公司综合了文献资料，数据库信息，专家意见和用户反馈，不断根据客户需要开发新产品，并使芯片中所包含的基因更完整，更精确。在目前的市场中，SuperArray所提供的信号通路范围最广，并且有针对人，小鼠和大鼠的PCR 芯片产品（参见表1以及产品目录）。在芯片设计中，还整合了预测资料和实验结果，帮助研究者系统地有针对性的开展研究。这些预设计的PCR芯片，分类详细，针对性强，使研究者无需自己一一挑选基因，节省大量时间和精力，实验过程简便快速，大大推进了生命科学研究进展。目前，预设计的PCR芯片涵盖了细胞凋亡，炎症反应，信号传导，癌症以及其他疾病等广泛的生物学通路和疾病。详细的芯片列表请登陆公司网站查询。
| 应用范围 | PCR芯片产品举例 | 芯片所包含的部分基因 |
| 生物学途径 |
人细胞凋亡 |
TNF 配体和受体 BCL2 家族成员 Caspases 死亡效应功能域 ATM和p53信号通路 |
| 功能或者结构相关基因 | 小鼠细胞因子 （Cat. No. APMM-021） |
干扰素和白介素 骨形态发生蛋白 肿瘤坏死因子 多种生长因子 |
| 信号传导途径 | 人NFKB信号通路 （Cat. No. APHS-025） |
细胞外配体和受体 NFκB和IκB 家族成员 激酶 转录因子 反应基因 |
| 疾病相关 | 人癌症信号通路发现者 （Cat. No. APHS-033） |
细胞周期控制和DNA损伤修复 细胞凋亡和细胞衰老 细胞黏附 血管生成 浸润和肿瘤转移 |
表1 SuperArray 提供的PCR Array产品举例
订制的PCR芯片
如果现有的产品无法满足研究者的特定需要，SuperArray还可以提供从设计到芯片生产的完整服务，为研究者提供使用先进的PCR芯片的便捷服务。客户订制芯片服务为研究者提供以下便利：1）在使用表达谱基因组芯片后，对从基因组水平筛选出来的一组基因进行验证；2）在现有产品的基础上作适当调整以适应特殊需要；3）完全从头设计，适用于在现有的预设计PCR芯片中尚未包括的某个信号通路或者一组基因。若研究基因数目少于84个，还可以将96孔PCR芯片进一步分成更小的形式，从而可以在一次PCR反应中研究多个样品。或者进行多次重复。
有了这些产品和服务，研究者在利用这项新技术时，可以专注于研究自己所感兴趣的特定基因组合时，实验中也更加省时省力。
PCR 芯片实验体系
完整的PCR芯片实验体系包括RT2ProfilerTM PCR芯片，RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反应体系和cDNA合成试剂盒。所有这些组分均为基于SYBR Green的实时定量PCR反应优化。精心设计的引物和优化的PCR反应体系一起，为PCR芯片的特异性提供保证。在反应体系中还加入了指示染料，用于检测PCR反应平台的可靠性。
RT2 PCR引物和RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反应体系
采用PCR芯片开展研究，技术上的难点是如何在同一次实验中，相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。为此，SuperArray首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和PCR反应体系，适应PCR芯片的要求。
RT2ProfilerTM PCR芯片引物的特点
通过计算机分析和实验验证，引物达到以下要求：
1、特异性：通过BLAST等比对方法，检测确认引物在相应物种（人，小鼠或大鼠）全基因组中的高度特异性，有效避免非特异性产物产生。并通过实验证明引物不会扩增E.coli基因组，后者是Taq DNA多聚酶的常见污染源。
2、均一性：所使用的引物的CG含量，解链温度（Tm），以及其他一些化学的和物理的特性都相似，以保证在相同的PCR条件（尤其是相同退火温度）下，芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。
3、扩增效率：引物扩增的片段大小均在100到200bp左右，确保在相同的反应时间内，不同的基因均能扩增出完整片段；并增强引物3’ 端的铆定能力，减少引物二聚体和非特异性退火的发生。
RT2ProfilerTM PCR芯片PCR反应体系的特点
在基于SYBR Green的实时定量PCR反应中，PCR反应体系也起到重要作用。严格控制的热启动Taq酶是一个关键因素。RT2 Real-TimeTM PCR反应体系采用了一种独特的，经过化学修饰的热启动Taq酶，只有在热激步骤之后，酶的活性才能完全发挥。在严格控制反应条件的情况下，在较低温度下发生的非特异性引物结合无法进一步扩增。其他的反应体系则常常将这些模板进一步扩增成为非特异性产物，造成假阳性结果。此外，Superarray还对RT2 Real-TimeTM PCR反应体系中的化学组分进行优化，进一步减少了引物二聚体的形成，并能保证最难扩增的片段都得到极高的扩增效率。PCR芯片结合了高质量的PCR引物设计和RT2 Real-TimeTM PCR反应体系，为PCR的高芯片质量提供了保证。
表格2总结了RT2ProfilerTM PCR芯片的特点。
| 芯片设计 | 84个通路特异性基因 |
| 5个看家基因 | |
| 1个基因组DNA参照 | |
| 3个反转录参照（RTC） | |
| 3个阳性PCR参照（PPC） | |
| 引物设计 | 特异性：序列比对筛选 |
| 一致性：统一的熔解和退火温度 | |
| 反应效率：短的扩增片段 | |
| 反应体系 | 热启动Taq酶： 避免引物二聚体等的产生 异性引物结合无法进一步扩增 |
| 反应体系为SYBR green实时定量PCR优化 |
表2 RT2ProfilerTM PCR芯片的特点
RT2ProfilerTM PCR芯片特点灵敏度
研究者总是希望能检测到表达量相当低的基因，有时候，研究者得到的起始总RNA量也很少，但仍希望能进行实时定量PCR检测。为了满足研究者的这些需要，Superarray严格检测了PCR芯片系统的灵敏度。例如，Superarray使用PCR芯片检测了一系列总RNA样本，这些样本的浓度都不相同，使用的PCR芯片为炎症细胞因子和受体基因芯片，通常，这些基因的表达量都是很低的。图3将阳性信号的比例（Ct<35的基因所占百分比）与相应的总RNA量对应起来作图。结果表明，当起始的总RNA范围在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）时，每张PCR芯片的阳性信号比率均超过85%。对于表达量更高的基因，芯片检测的灵敏度还会大大提高，即在起始RNA量更低的情况下，芯片能够检测到的阳性信号比例更高。值得注意的是，起始的总RNA量最好不要低于0.5-1.0ug，否则会造成阳性信号损失。由于阳性信号比例在起始RNA量低时会显著下降，所以在实验中，检测的最低RNA量不少于5.0ng。
图3当总RNA量低至5.0ng时，使用RT2ProfilerTM PCR芯片实验体系仍能获得很高的阳性信号比例
RNA样品为XpressRefTM人总RNA（GA-004），起始RNA量分别为0.1，1.0，5，10，50，100和1000ng）。芯片为炎症细胞因子和受体PCR芯片（APHS-011A）。采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系（PA-011）。阳性信号的比例（Ct<35的基因所占的百分比）与对应的总RNA量做图。
特异性
PCR芯片体系的设计和优化都是针对基于SYBR green的实时定量PCR反应。由于SYBR Green与非特异的双链DNA也会发生反应，为了获得高特异性，需要保证引物只扩增出特定的目的片段，从而使基于SYBR Green的PCR芯片能够准确的检测基因表达水平。Superarray通过实验对设计合成的引物进行了验证，保证引物扩增的产物是单一的，基因特异性的，没有引物二聚体，也没有非特异性扩增产物。
下面是一个检测PCR芯片特异性的实验。检测PCR芯片中TGFβ和骨形成蛋白（BMP）家族各基因的熔解曲线，并且对PCR产物进行凝胶电泳实验，该家族的基因同源性很高。图4显示了BMP基因家族各基因扩增产物的熔解曲线和电泳结果。如图所示，各熔解曲线均为单峰，电泳条带亦单一，并且条带大小与预期值一致。结果表明， PCR 芯片扩增出基因产物特异性高，即使相同RNA样品中同一基因家族的同源基因也可以区别。优化的体系在SYBR Green检测中表现出高特异性，而这种特异性通常被认为只能在使用更加昂贵的基于探针的方法才能获得。
图4 PCR芯片的高特异性 RT2ProfilerTM PCR芯片对所检测的基因显示出高特异性
RNA样品为XpressRefTM人总RNA（GA-004，5ug），PCR芯片为人TGFb/BMP信号通路PCR 芯片（APH-035A），采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系（PA-011）。通过标准熔解反应步骤获得熔解曲线（A），产物进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测（B）。
重复性
实时定量PCR的定量特性使得PCR芯片的重复性强。为检测重复性，2位研究者采用了同样的总RNA样品，分别进行了4次重复试验。两个人使用同种PCR芯片，但批号不同，并且每个人都分两天进行试验。比较两位研究者分别做的4张芯片的原始Ct值。图5显示了比较结果的图示和相关系数。每一组比较结果均获得理想的曲线，斜率为1.0，相关系数均不小于0.99。结果显示，PCR芯片实验体系的重复性高，不同批次的芯片，不同时间进行实验，不同的重复设计，在原始值水平都能获得很高的重复性。
图5 PCR芯片的重复性 PCR芯片具有高重复性
RNA样品为XpressRefTM人总RNA（GA-004，5.0ug），PCR芯片为人药物代谢PCR 芯片（APH-022A），采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系（PA-011）。两位不同的研究者分别进行了4次重复。A图比较了原始的Ct值。B的表格则说明A中每组比较获得的曲线的相关系数。
由于PCR芯片在技术上具备很高的重复性，在确保RNA样品制备良好，PCR芯片实验操作正确的情况下，所观察到的基因表达水平的差异都是所研究的样本本身的生物学特征所引起的，而不是由于实验技术所造成的差异。表3总结了RT2ProfilerTM PCR芯片的特点。
| 灵敏度高 | 在仅用5ng总RNA时，可获得85%的阳性信号 |
| 线性范围广 | 至少10的5次方 |
| 特异性强 | 引物扩增出单一的，靶基因特异的产物 |
| 重复性佳 | 同一实验室重复实验，比较原始Ct值的相关系数（R）≥0.99 不同实验室重复实验，比较基因表达倍数的相关系数（R）≥0.97 Ct的平均标准差为0.25 |
表3 RT2ProfilerTM PCR芯片的特点
总结：
RT2Profiler PCR芯片是研究一组特异性基因表达水平的理想方法。基于SYBR green 的实时定量PCR方法，适用面广，简单方便，使PCR芯片具有广泛的应用前景。选择合适的芯片模式和相应的反应体系，即可开展PCR芯片实验。芯片包括预设计的通路特异性PCR芯片或者客户订制PCR芯片。PCR芯片具有与实时定量PCR相当的灵敏度，特异性和重复性。PCR芯片的设计思路，使实验设计和实际完成实验的时间大大缩短，对结果的分析也更直接有效。使用PCR芯片，每张芯片使用的总RNA样品量最少可低至0.5ng，最多则可达到5.0ug。PCR芯片的特异性保证扩增产物的唯一性和基因特异性。因此，检测得到的基因表达水平差异真实的反映了所要研究的基因的情况。PCR芯片的重复性（intra-lab的相关系数为0.99）保证实验结果是可重复的。RT2Profiler PCR芯片结合了实时定量PCR的优点和芯片的高通量，是研究者开展研究的得力工具。
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