末端转移酶标记技术（TUNEL法）检测细胞凋亡

材料与试剂

1. TUNEL试剂盒：

①从瓶2中取出标记液100μl分别作为两个阴性对照。

②将瓶1的全部溶液50μl加入瓶2剩余的450μl标记液中，使其成为500μl的TUNEL混合物。

2. POD转换液（一旦溶解，储存于4℃，不得再冻存）

3. 漂洗液：PBS

4. 固定液：4%多聚甲醛（用pH7.4的PBS配）。

5. 封闭液：0.3%H2O2 （用甲醛配）。

6. DBA:金属增强底物剂。

7. 细胞透化液：0.1%Trition X-100（溶于0.1%柠檬酸钠）。

8. 蛋白酶K：10～20μg/ml，溶于Tris-HCL，pH7.6）。

操作方法

1、贴壁细胞、细胞甩片的染色方法

固定：用新鲜配制的4%多聚甲醛室温固定30min；

内源性过氧化物酶的封闭：用PBS轻洗，放入封闭液中，室温下孵育30min；

细胞透化：用PBS轻洗玻片，滴加透化液，冰上4℃孵育2min；

标记：PBS洗两次，将标本玻片吹干，滴加50μl TUNEL反应混合物（注意要在单层细胞上均匀分布TUNEL，为避免蒸发，将玻片置于湿盒中）；同时设立对照：

A）阴性对照：每一实验均应设立对照，每孔加50μl标记液（无末端转移酶）代替TUNEL反应混合物；

B）阳性对照：每一实验均应设立对照，用微球核酸酶或DNA酶I处理已固定/透化的细胞（1μg～1mg/ml，室温10min），以诱导DNA链断裂。37℃孵育 30min；

PBS洗3次；

单个转换和分析：标本吹干，加50μl转换POD（注意要在单层细胞上均匀分布POD，为避免蒸发，将玻片置于湿盒中）37℃ 30min，PBS洗3次，加50～100μl DAB底物液，室温下孵育10min，PBS洗3次，加盖玻片；

置于光学显微镜下观察（在光学显微镜观察前，亦可对标本进行反相染色）；

结果判断

在光学显微镜下观察，凋亡细胞核染成棕黄色，可见核形态呈碎点状；在荧光显微镜下观察，正常细胞染成淡绿色荧光，凋亡细胞染成黄绿色荧光，凋亡细胞可见核小体。细胞玻片经过POD转换后，在光学显微镜下观察，凋亡细胞核染成棕黄色，可见核形态呈碎点状。

2、石蜡切片的染色方法

按常规步骤脱蜡、再水合（按HE染色的脱蜡、水合方法）；

滴加蛋白酶K于组织片上，作用30min，PBS洗2次；

其他染色步骤见：细胞染色步骤②～⑦；

结果分析：同上。

3、冰冻切片的染色方法

用4%多聚甲醛固定组织30min，PBS冲洗（注意：储存时可用无水乙醇固定组织2 min，然后存于-20℃保存）；