TUNEL细胞凋亡检测程序

一、原理与意义：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂

1、器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。

2、试剂：试剂盒含TdT 2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；

3、自备试剂：

（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；

（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；

（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。

（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；

（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；

（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）；

（7）DAB工作液（临用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）

（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀释贮存液1 mg/ml）。

（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。

三、实验步骤

1、脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次；

2、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min）；

3、浸洗：0.85%NaCl×5 min⇒PBS洗5 min；

4、固定：浸入4%多聚甲醛15 min；

5、浸洗：PBS 5 min×2次；

6、细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT；

7、浸洗：PBS洗5 min；

8、固定： 浸入4%多聚甲醛5 min；

9、浸洗：PBS 5 min×2次；

10、平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5~10） min；

11、制备TUNEL反应混合液：处理组用1ul rTdT+1ul 生物素标记的dUTP+98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100ul DNase 1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。

12、标记反应：加100ul TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。

13、终止反应：浸入2×SSC 15 min；

14、浸洗：PBS 5 min×3次；

15、封闭POD：浸入0.3%H2O2 15 min；

16、浸洗：PBS 5 min×3次；

17、酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1：500 PBS稀释）30 min；

18、浸洗：PBS 5 min×3次；

19、DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。

20、用去离子水冲洗几次；

21、用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100%各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。

22、加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。

四、注意事项

1、结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。

2、初次检测细胞凋亡，最好设置阳性对照片。

3、血细胞含量高的组织，尽可能延长过氧化氢的灭活时间。

4、苏木素的复染时间需要摸索。

5、每片所加试剂可调整，一般30~100 ul不等，但也要防止液体挥发而干片，且反应均在放置湿盒内。