植物细胞程序性死亡的TUNEL检测

植物细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是植物生长发育过程或环境胁迫下，由基因调控主动移除多余的、受伤细胞的过程。PCD 从胚胎发生一直到个体的死亡，伴随植物生长发育的每个阶段，包括胚胎发育过程中胚柄细胞的移除、单子叶植物种子萌发过程中糊粉层的解体、木质部管状分子的分化、通气组织和表皮毛的形成、性别的决定、花药绒毡层的降解、花器官的脱落、花粉的自交不亲和、叶片形状的重构和叶子的衰老等。

同时，PCD 也参与了植物的免疫反应和对环境信号的应答，如真菌入侵后的超敏反应；高浓度盐、极端温度、重金属离子、紫外线等均能诱导植物 PCD。植物 PCD 过程中，会表现出细胞核的凝聚、DNA 的片段化、细胞质凝集和质膜塌陷等现象。其中细胞核的变形及 DNA 的片段化是 PCD 过程的关键特征。因此，利用 4'，6-蘇基-2-苯基吲哚（DAPI）标记和末端脱氧核糖核苜酸转移酶（TdT）介导的脱氧核昔酸缺口末端标记法（TUNEL 检测），可观察到 PCD 过程中，细胞核的形态变化及 DNA 的片段化。基因组 DNA 会发生断裂降解，会产生的一系列 DNA 的 3'-OH 端。在末端脱氧核糖核昔酸转移酶的作用下，可将脱氧核糖核昔酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-OH 端，在荧光显微镜下可观察到荧光。

花蜜腺是分布于花器官中的一类分泌糖类的腺体，用于吸引昆虫传粉。当完成传粉后，部分植物的蜜腺也失去存在的意义，因此，蜜腺会通过 PCD 途径而逐渐解体。圆叶牵牛分布广泛，花期短，其花蜜腺是检测 PCD 特征理想材料。

器材：

圆叶牵牛开放前的花蕾及开放 2 h 的花。

器具：

① 染色缸

② 湿盒

③ 荧光显微镜

试剂：

① PBS 缓冲液

② 4% 多聚甲醛

③ 蛋白酶 K（10~20 μg/mL Tris/HCl 缓冲液配制，pH7.4）

④ TUNEL 检测试剂盒（TaKaRa 公司，中国大连）

⑤ DAPI（lmg/L 的 DAPI 染液溶于 10 mmol/L Tris/HCl 缓冲液，pH7.4）

⑥ 石蜡切片制作相关试剂

⑦ DNase I

植物细胞程序性死亡的TUNEL检测的基本过程可分为如下几步：

（1）取圆叶牵牛开放前的花蕾及开放 2 h 的花，剥去花萼、花冠、雄蕊，露出雌蕊及子房基部的蜜腺（图 30-1），切取花蜜腺，4% 多聚甲醛固定 12 h，制作花蜜腺横切面的石蜡切片。

（2）石蜡切片脱蜡（两次纯二甲苯，1/2 无水乙醇 + 1/2 二甲苯，各 30 min），经乙醇系列复水（100%、100%、95%、85%、70%、50%、30%，各 5 min），蒸馏水冲洗 2 次。再浸入（pH7.4）PBS 缓冲液（现用现配）中漂洗 2 次，各 5 min。蛋白酶 K 温育 30~40 min（37 ℃），缓冲液漂洗 3 次，每次 5 min。依照 TaKaRa 公司提供的 In situ Apoptosis Detection Kit（RNase-free，TaKaRa，中国大连）进行操作。阳性组用 2 μl DNase I 处理 15 min，再滴加 5 μl TdT 酶和 45 μl Labeling Safe Buffer 混合液（冰上混合，即用即配）。阴性组滴加 50 μl Labeling Safe Buffero 反应组加入 5 μl TdT 酶和 45 μl Labeling Safe Buffer 混合液（冰上混合，即用即配）。然后在 37 ℃ 避光条件下温育 90 min。PBS 缓冲液漂洗 3 次，各 5 min 后终止反应。最后将样品滴加 20 μl DAPI 染液，避光染色 20 min，水洗 3 次，每次 5 min，荧光封片液封片。

（3）荧光显微镜观察。将封片后切片样本置荧光显微镜观察，先将荧光激发模块选择「2」（激发波长 365~425 nm，发射波长 454 nm），观察 DAPI 染色结果，细胞核呈浅蓝色荧光，没有发生 PCD 的细胞核形态较为规则，荧光亮度均匀。而发生 PCD 的细胞核形态不规则，荧光亮度不均匀，部分区域特别亮（染色体凝聚）。观察拍照后，将荧光激发模块选择「3」（激发波长 420~485 nm，发射波长 520 nm），观察 TUNEL 检测结果，发生 PCD 的细胞核（DNA 断裂）被标记为绿色荧光，没有发生 PCD 的细胞核则没有绿色荧光信号。阴性对照中，细胞核能被 DAPI 染色，但无法检测到 TUNEL 荧光信号。观察中要注意，植物的木质化组织也会产生绿色的自发荧光，如导管分子，因此，观察时要注意区分，并做好阴性对照。