原理
材料与仪器
要分析的新鲜组织
含1% （m V)多聚甲醛的PBS (低温揽拌溶解过夜 用之前过滤) Tris缓冲盐（TBS) 含 0.1% (V V) H2O2 的 TBS TdT反应液 TdT 地高辛（digo×igenin 下同）-dUTP混合液 2% (V V)马血清或含FBS的TBS 羊抗地高辛初级抗体溶液 HRP共轭的抗羊二级抗体溶液 AEC底物工作液 Mayer 苏木精
Crystal Mount 封固介质 疏水的棚栏载玻片标志（如 PAP Pen) Coplin广口瓶或染色托盘 加湿箱
含1% （m V)多聚甲醛的PBS (低温揽拌溶解过夜 用之前过滤) Tris缓冲盐（TBS) 含 0.1% (V V) H2O2 的 TBS TdT反应液 TdT 地高辛（digo×igenin 下同）-dUTP混合液 2% (V V)马血清或含FBS的TBS 羊抗地高辛初级抗体溶液 HRP共轭的抗羊二级抗体溶液 AEC底物工作液 Mayer 苏木精
Crystal Mount 封固介质 疏水的棚栏载玻片标志（如 PAP Pen) Coplin广口瓶或染色托盘 加湿箱
步骤
1) 准备5〜8μm的冰冻切片，室温过夜晾干载玻片。石蜡切片也可以用；切片应该事先制备，水化，然后真空干燥。
2) 用PAP笔在每个切片周围的玻璃上划一条疏水界线。
3) 用1%多聚甲醛完全覆盖整个切片，在一个密闭的箱内室温孵育30 min。
4) 倒掉多聚甲醛，洗涤载玻片在含TBS的广口瓶或含染色托盘内室温孵育5 min，在孵育过程中，载玻片从该溶液浸入、取出3〜4次。
5) 用含0.1%(V/V) H2O2的TBS覆盖切片。置一个密闭箱室温孵育30 min,以猝灭内源的过氧化物酶活性。
6) 按照步骤4用TBS洗涤，用TdT反应液覆盖切片，以冲洗掉TBS。
7) 尽可能地去除反应液，加入25μL的TdT/地高辛-dUTP混合液。在加湿箱内37℃ 解育45〜60 min。
8) 用TBS洗涤载玻片一次，然后用2%马血清或含FBS的TBS洗一次，洗涤过程参照步骤4。
9) 用羊抗地高辛初级抗体溶液覆盖切面，在一个密闭箱内室温孵育1 h。
10) 按步骤8洗涤载玻片，然后用HRP共扼的抗羊二级抗体溶液覆盖切片，密闭箱内室温孵育1 h。
11) 按步骤8洗涤载玻片，然后用AEC底物工作液覆盖切片，室温孵育10〜20 min。
12) 按步骤8洗涤载玻片，在Mayer苏木精里孵育0.5〜1 min复染。然后用自来水在 Coplin广口瓶内洗漆5 min。
13) 擦去切片周围多余的水，用Crystal Mount封固盖玻片。
来源：丁香实验
