用TUNEL流式细胞定量凋亡细胞

1a)多色分析：进行免疫荧光染色。重悬染色细胞于PBS，转移含5×10⁵个细胞的细胞液至一 12 mm×75 mm圆底离心管。必须确保用于多色染色的荧光团没有被TUNEL步骤的固定剂破坏。FITC、PE和Texas红不受影响。

Duochromes (PE和Texas红的结合物，如Red 613)也不受影响，但是别藻蓝素（APC)会被固定剂破坏。

1b) TUNEL检测：转移含5 ×10⁵的细胞液至一 12 mm×75 mm圆底离心管。

2)加入1〜2 ml PBS,然后 4℃，300 g (IEC 269转子则为1200 r/min)离心5 min 沉淀细胞，弃上清。重悬沉淀于250μL PBS，然后边轻柔涡旋振荡边5〜10 s—滴一滴地加入750μL冰冷的95%乙醇。4℃孵育20 min。

3)加入2 ml PBS洗涤细胞，4℃，400 g离心5 min。弃上清。

4)倾斜试管用余下的缓冲液重悬细胞，边轻柔涡旋振荡，边间隔5〜10 s滴加入1 ml多聚甲醛固定液。室温孵育30 min。

5)按步骤3同样用PBS洗涤细胞，如果需要可于4℃暗室储存几天。

6)按步骤3同样洗涤细胞，用0.5 ml TdT反应液替代PBS。弃上清后立刻反转试管口于吸水纸上，以此尽可能多地弃除上清。

7)加入50μL TdT/生物素-dUTP混合液到细胞沉淀里，于37℃孵育45 min。

8)按步骤3同样用PBS洗涤细胞，然后加入10μL FITC-链霉亲和素结合物（以制造商推荐的稀释液）。室温孵育30min，然后按步骤3用PBS洗涤细胞。

9)进行流式细胞仪分析