细胞组分的分析方法――定量细胞化学分析技术
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1.概述
流式细胞光度计(flow cytometry)可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。
细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异染色，然后将悬液中的细胞以1个细胞／ms的速度(1 000万细胞/h)一个个地通过流式细胞仪，此时检测器便可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量，并根据要求将该成分含量不同的细胞分离出来。如果染色过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可以继续培养。
2.工作原理
流式细胞光度计(简称FCM)是将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ―射线能谱术
及电子计算机等新技术与显微荧光分光光度计密切结合的高度精密仪器。在电子计算机操作 程序控制下能灵敏而快速地对大量单细胞样品进行多信息分析与测定。目前，FCM技术已广泛地应用于生命大分子物质的定量、细胞周期分析、细胞表面抗原、受体、染色体、核浆比例、活细胞分类等细胞生物学各领域的研究工作中。
其主要工作原理是：经荧光染色的单细胞悬液被高压压入流动室内，在PBS或生理盐水等壳液(Sheath Fluid)的包裹和推动下形成单细胞状态，并以每分钟5000―10000个细胞的高速度从流动室内喷出。在与细胞束呈90°角的方向，受到来自氩离子激光器的激光束照射而激发荧光。通过各种物镜及滤光片将从不同角度收集的荧光投射到光电倍管并转换为各种强弱不等的电脉冲信号显示出来。这些信号输到电子计算机中贮存，经处理和分析便可得到多种信息参数。进行细胞分类时，根据需要对含细胞的水滴选择性充电，在带有高电压的偏转板作用下，带正电荷的水滴落入左方收集管内，带负电荷的水滴落入右方收集管内，不带电荷的水滴进入中间的收集管。分类主要根据细胞的荧光强度，即单细胞DNA含量。
3.FCM系统调试：
以FACS-Ⅲ型机为例，调试的原则是：得到较高的分辨率，即对某一特殊样品测得的变 化常数CV值，CV值越小越好。得到较高的灵敏度，即可测出最小荧光分子数。
调试仪器要有理想的标准品，其条件是：①稳定；②颗粒大小和荧光性要均匀；⑧标准 品本身的CV值要低于仪器的CV值；④易得，易制成悬液。目前常用的标准品有：④荧光 微球，⑥鸡红血球悬液，它易得，制备方法简单，易保存，且血红蛋白可自发荧光。
4.样品制备过程
着重介绍单细胞悬液的制备方法，这是生物学工作者最为关心的问题。悬液培养样品或 各种腹水细胞本身就是单细胞悬液，可直接使用。下面介绍单层培养样品及实体组织的制备方法。
(1)单层培养的样品：器材和试剂：玻璃滴管数只(灭菌)；5ml移液管5只(灭菌)；10ml移液管3只(灭菌)；离心管数只(灭菌)；灭菌超净台；恒温水浴箱；离心机、冰箱；PBS液(灭菌)；胰蛋白酶溶液。
步骤：①去掉培养基；②用5ml冷PBS滴轻轻冲洗细胞后去掉；⑧加2毫升胰蛋白酶液，37℃保温5分钟，轻轻摇动培养瓶或用滴管吹盯数次使细胞最大程度游离；④加8ml含血清的培养基以抑制酶活性，⑤把细胞悬液移到离心管内，250g离心5分钟；⑥弃上清，将细胞重新悬于10ml冷PBS中，搅匀；⑦250g离心5分钟，弃上清加5ml乙醇固定，保存于4℃备用。
(2)实体组织：器材和试剂：眼科剪、眼科镊各一把；50ml小烧杯数个；玻璃滴管数只；小块双层纱布；普通光学显微镜；恒温水浴箱；离心机；Hank’s平衡盐水；分离液；中和液。
步骤：①将组织块剪碎，以Hank’s平衡盐水洗去红细胞；②加分离液，37℃水浴，轻轻搅拌直到液体混浊；⑧在显微镜下检查细胞分离情况；④静置数分钟后轻轻倒出悬液，以双层纱布过滤，剩下的细胞团块可重新加分离液分离；⑤加入与细胞悬液等体积的中和液；⑥用滴管吹打10次，室温下静置5分钟后再放在冰上，⑦250g离心5分钟；弃上清，细胞重新悬于生理盐水中备用。
对于不同组织，酶用量和pH均可改变。除胰蛋白酶外，还可以用胶原酶、胰肽酶E、透明质酸酶或联合使用。
因为酶可以消化细胞膜上的某些成份，所以有人用非酶物质分离细胞。用TPB(tetraphenylborom)分离肝、脑、肾和结缔组织，但TPB能抑制细胞代谢。下面简单介绍Rappapont和Howze用TPB钠盐分离C3H小鼠肝脏细胞的过程。
器材和试剂：薄刀片；10ml移液管2只；玻璃滴管数只；带22号针头的注射器1个；磷酸缓冲液；蔗糖-盐溶液；TPB分离液。
步骤：①将肝组织切成3―5ml的薄片；②加10mlTPB分离液；③冰浴1―2小时，并用滴管上下吹打数次；④将细胞液通过一22号针头，形成单细胞，⑤250g离心5分钟，并以生理盐水洗2次去掉分离液。
被分离的肝细胞数目随TPB浓度的增加而增加，其最适浓度范围是每升10的负5次方至10的负2次方摩尔。
通常是将实体组织切碎，用带金属网或尼龙网的注射器制成单细胞。但此法易引起细胞破碎和丢失。Crissman(1976)的方法是：①将实体瘤切碎；②碎组织通过一500nm孔径的Teflon网；⑧细胞被收集于生理盐水液中；④此细胞悬液被通过一个100或60nm孔径的尼龙GM筛；⑤离心使细胞沉淀；⑥细胞沉淀直接悬液于染色液中。
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