细胞组分的分析方法――线粒体的分离与观察
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线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质――脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
3．0．25mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris―盐酸缓冲液(pH7．4)
加蔗糖到0.25 mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖
4．0．34mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris―盐酸缓冲液(pH7．4
高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器。
1．制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0～4℃的0．25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0．25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2．差速离心。先将9ml 0．34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻控温高速离心机进行差速离心（见图）。
3．分离物鉴定。
(1) 细胞核；取细胞核沉淀一滴涂片，用甲醇―冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液(原液10～20倍稀释)染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
(2) 线粒体；取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片，镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其生理活性。
作 业
将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
1．分离介质0．25mol/L及0．34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?有什么作用?
2．分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置室温2h后再染色，比较二者着色的差异。
50ml 0．1 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42ml 0．1 mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因―线粒体DNA等目的。
1．玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培肓2～3d。待芽长到1～2cm长时剪下约15g，放0～4℃1h。
3，用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。
4，取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。
5．沉淀为线粒体，可存于0．3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0～4℃进行。
线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1％詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
