细胞组分的分析方法――核酸序列的原位杂交
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寡聚核苷酸是一种短小的单链分子,比cDNA更易穿透组织细胞,并且可按基因片段的核苷酸序列人工合成。因此近年来人们常用它来制备核酸探针。
主要器具有高速离心机,电泳仪,真空干燥箱,恒温摇床,超声波发生器等。
环境、器皿的清洁和药品的纯度是该实验成功的关键。RNA容易被RNA酶水解,而RNA酶非常稳定,所以标本和药品及器皿中应避免RNA酶的污染。
本实验所用探针是玉米17SrRNA的cDNA,它是以1.5kb的片段插入在PBluescriptⅡSK(一)中MCS的saci位点上。
(1)将大肠杆菌(E・coli)JM109单菌落接在5ml LB培养液中,37℃振荡培养过夜。
(2)以1%的接种量接入50ml LB培养液中,37℃振荡培养至OD600大约为0.3~0.4时倒入离心管,冰浴10min,4000rpm离心10min,收集菌体。
(3)将菌体悬浮于25ml预冷的50mmol/LCaCl2溶液中,冰浴30min。离心收集菌体,并重新悬于3ml 50mmol/lCaCl2中。0℃放置12-16h,使之成为感受态细胞。
(4)取重组质粒0.1μg,加在200μl感受态菌体中,冰浴30min,于42℃热休克2min后再冰浴2min。
(5)取lml LB培养液加入到上述菌液中,37℃培养45min。逐级稀释后,用内含氨苄青霉素(60μg/ml)的LB培养液涂平板,37℃培养至菌落出现。
(1)对在氨苄青霉素平板上长出的菌落进行一次复筛,并培养菌体。
(2)按照微量DNA的提取方法(Sambrok et al.,1989)提取微量DNA,进行电泳,检测出含有重组DNA质粒的转化子。
(2)取200ml培养液,4000rpm离心10min,收集菌体,弃上清液。
(3)加入4ml溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris,10mmol/L EDTA,pH8.0),加入溶菌酶至终浓度为4~6mg/L,振荡混匀,冰浴10min。
(4)加入8ml新配制的溶液Ⅱ(0.2N NaOH,10%SDS),温和颠倒离心管5次,冰浴5-10min。
(5)加入6ml预冷的溶液Ⅲ(5mol/L醋酸钾60ml,冰醋酸11.5ml,重蒸水28.5ml),颠倒离心管使之均匀后冰浴15min。
(8)12000×g离心20min,弃上清液,取沉淀,真空干燥。
(9)将沉淀溶于500μl TEB(10mmol/LTris-HCl,lmmol/L EDTA,pH7.5),加RNase至20μg/ml,37℃作用1-4h,以除去RNA。
(10)加等体积的饱和酚,振荡混匀后,10000rpm离心6min,取液相。
(11)在液相中加入等体积的酚:氯仿(1:1),振荡混匀后10000rpm离心6min,取液相。
(12)在液相中加入等体积氯仿,振荡混匀,10000rpm离心6min,取液相,并加入2倍体积的冷乙醇,-20℃沉淀DNA。
(2)将反应后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳2―3h,在紫外灯下确定DNA片段的位置,从凝胶上切下相应DNA片段的凝胶块。
(4)从透析袋中吸出溶液,再加450μl 0.2×TEB冲洗透析袋,两次溶液合并后以12000rpm离心15min,除去凝胶碎块。
10×生物素反应液:0.5mol/L Tris-HCl,pH7.5,50mmol/L MgCl2。
dNTP溶液:50mmol/L Tris HCl,pH7.5,每种dNTP的最终浓度为0.3mmol/L。
生物素化dUTP溶液:Bio-dUTP溶于50mmol/L Tris-HCl(pH7.5),最终浓度为 0.3mmol/L。
DNA多聚酶Ⅰ溶液;浓度为3单位/μl,溶于0.1mol/L磷酸钠,50%乙醇,lmmol/L DTT混合液中。
DNaseⅠ溶液:浓度为0.1μg/μl,溶于10mmol/L Tris-HCl,pH7.5,lmg/ml牛血清白蛋白混合液中。
(1)将硝酸纤维素膜剪成合适大小的长条,在2×SSC(0.15mol/L NaCl,0.015mol/L柠檬酸钠,pH7.4,等于1×)中浸泡过夜。
(3)将标记后的探针进行适当稀释,95℃水浴加热2-5min,使DNA变性。
(6)晾干后,将点样的硝酸纤维素膜夹在滤纸中间,80℃烘烤2h。
(7)用0.01mol/L PB,pH8.2洗涤3次,每次15min。
(8)将与胶体金相连的链霉亲和素用pH8.2的PB进行稀释,并将膜放入该液中,室温孵育60min。
(1)按电镜常规制片程序,将用K4M树脂包埋的玉米根、松根等材料进行超薄切片,将其捞在镍网上。
(4)将标记的探针加热至100℃,变性5min后马上放入冰水中,0℃冰浴10min。
(5)在预杂交液中加入变性的探针,终浓度约为0.5μg/ml,此液即为杂交液。
(6)将杂交液滴在Parafilm膜上,将预杂交的切片漂浮在杂交液上。
(8)载片镍网依次用2×SSC,1×SSC,0.1×SSC,重蒸水各洗两次,每次5min,空气干燥。
(9)杂交后的切片用3%BSA(0.1mol/L PB配制)封闭5min。
该实验的结果是,在玉米、松的染色体上有金颗粒分布,对照为阴性。