凝胶层析法测定蛋白质分子量实验步骤

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一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术 。

二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子 不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
凝胶层析分离 原理示意图参见64页的“图 3－5”。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱 中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：
Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)
在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子 量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
65页的“图 3－6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积（V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的示意图。
65页的“图 3－7”示出了凝胶层析柱中的几种层析峰。
有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C为常数。

同样可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。

三、器材与试剂
（一）器材
1. 玻璃层析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒压贮液瓶）
3. 自动部分收集器
4. 紫外分光光度计
5. 100ml试剂瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml烧杯
8. 50ml、100ml烧杯
9. 10ml（或5ml）刻度试管
（二）试剂
1. 标准蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）
（4）溶菌酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白质样品：由实验室准备
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脱液1000ml）

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仪器和试剂

仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分收集器

试剂

待测样品：胰岛素、牛血清白蛋白

蓝色葡聚糖2000;Sephardex G-75;洗脱剂

实验步骤

1.凝胶溶胀

凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，结果较好。

取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同)，或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。

2. 装柱与平衡

装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。

将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。

3. 上样与洗脱

样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量(约1ml)洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1—2%;制备用量为柱床容积的20%~30%。

4. 收集与鉴定

用自动部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。

5.凝胶柱的处理

凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。

计算

分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。

注意事项

各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。

始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。