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凝胶层析法测定蛋白质分子量实验步骤

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分子量测定的实验方法与强兵利器

一、实验目的

1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术 。

二、实验原理

凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。

用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。

对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子 不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关:
Kav = (Ve-V0)/(Vt-V0) ----------- (1)

在限定的层析条件下,Vt和V0都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大

有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分离效果差或根本不能分开。

在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V0及Ve的值,从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系:

Kav =-b logMw + C --------- (2)
其中 b,C为常数。

同样可以得到:

Ve =-b’logMw + C’ --------- (3)

其中 b’, C’为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。

三、器材与试剂

(一)器材

1. 玻璃层析柱((20mm×60cm)

2. 恒流泵(或下口恒压贮液瓶)

3. 自动部分收集器

4. 紫外分光光度计

5. 100ml试剂瓶

6. 1000ml量筒

7. 250ml烧杯

8. 50ml、100ml烧杯

9. 10ml(或5ml)刻度试管

(二)试剂

1. 标准蛋白

(1)牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所)

(2)鸡卵清清蛋白:Mw=45,000(美国SIGMA公司)

(3)胰凝乳蛋白酶原A:Mw=24,000(美国SIGMA公司)

(4)溶菌酶:Mw =14,300

2. 未知蛋白质样品:由实验室准备

3. 0.025M KCl-0.1M HAC(乙酸)(洗脱液1000ml)

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仪器和试剂

仪器:层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分收集器

试剂

待测样品:胰岛素、牛血清白蛋白

蓝色葡聚糖2000;Sephardex G-75;洗脱剂

四、实验步骤

1.凝胶溶胀

凝胶颗粒要求大小比较均匀 ,可流速稳定,结果较好。

取葡聚糖Sephardex G-75干粉,加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同),或沸水浴中溶胀3小时,这样可大大缩短溶胀时间,而且可以杀死细菌和霉菌,并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。

2. 装柱与平衡

装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出,将层析柱垂直装好。关闭出口,向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液,然后在搅拌下,将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中,使之自然沉降,待凝胶沉降约2—3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉集,待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱,关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。

将洗脱剂与恒流泵相连,恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡,然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布,以防将来在加样时凝胶被冲起,并始终保持凝胶上端有一段液体。

3. 上样与洗脱

样品上柱是实验成败的关键之一,若样品稀释或上柱不均,会使区带扩散,影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。

先打开柱的出口,待柱中洗脱液流至距床表面1~2mm时,关闭出口,用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面,应避免将床面凝胶冲起,打开出口并开始计算流出体积,当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作,用少量(约1ml)洗脱液冲洗管壁2次。

最后加入少量洗脱液于凝胶上,使高出床表面3~5cm,旋紧上口螺丝帽,柱进水口连通恒流泵,调好流速,以每管3ml/10min流速开始洗脱。上样的体积,分析用量为柱床容积的1—2%;制备用量为柱床容积的20%~30%。

4. 收集与鉴定

用自动部分收集器收集流出液,每管4ml,紫外检测仪280nm波长处检测,最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。

5.凝胶柱的处理

凝胶用过后,反复用蒸馏水洗后保存,如果有颜色或比较脏,可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中,加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。

五、计算

分子量的测定和计算,一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve,并以它们的相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一直线,再测出待测样品的Ve,即可从图中确定它的相对分子质量。

注意事项

各接头不能漏气,连续用的小乳胶管不要有破损,否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体,并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生,则表示恒压瓶不漏气。操作过程中,层析柱内液面不断下降,则表示整个系统有漏气之处,应仔细检查并加以纠正。

始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分挥发,凝胶变干。也要防止液体流干,使凝胶混入大量气泡,影响液体在柱内的流动,导致分离效果变坏,不得不重新装柱。

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