关于稳定转染的几个问题

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xiangyu_16888：关于稳定转染 的若干问题

1 转染 后24小时以1：10的稀释比例加入新鲜的含G418的培养基中，其目的是什么?

2 此时换液是否将DNA-脂肢体复合物去处?

3 加入G418的量是按体积加还是按细胞数加?

4 转染 后培养基除了G418是否也加入双抗?

谢谢各位大虾了![color=red][/color]

bigbang_0_0认为：

1.利于两周后挑取单克隆 .

2.是.

3.按体积加.

4.是.

capricornkey认为：

1。G418是用于筛选单克隆的，若你转染 的质粒上不含有Neomycin这段基因，那你需要共转染pcDNA3，然后进行G418筛选;至于比例的问题，应该先摸下G418细胞致死最大量，然后确定比例;

2。脂质体一般都有毒性，长时间作用会使细胞损伤(尤其是Lipofenctine2000)，所以要换液;

3。如1所述，加时候算的话，按体积比较准确方便;

4。加双抗是为了避免细胞污染，刚转染后的细胞不能加，因为脂质体-DNA进入细胞的同时，抗体也会进入，损伤细胞;一般建议不加!

xiangyu_16888认为：

capricornkey 你好：谢谢你，还有一个问题想请教您，

悬浮培养的细胞即使死了也是悬浮着的，因此最大的问题就是怎么筛选?

capricornkey认为：

悬浮培养的细胞没有经验，确实有这个问题;

我觉得是不是得加大筛选力度，于96孔板挑单克隆，观察其生长情况，可能工作量很大，或者流式进行分选

纯属个人想象，没有做过~R~S~undefined