pTet-tTAK 稳定转染（第二轮）

tTA 是一种融合蛋白，它是由来自于大肠杆菌的四环素抑制蛋白和疱疹病毒的 VP16 蛋白的转录激活区域组成的。在缺乏四环素时，tTA 就结合到并激活位于基因前端的由 Tn10 和一个小的 CMV 启动子组成的七聚体结构的四环素抗性控制子（简称 Tet P）。

当 tTA 结合到 Tet P 后，有四环素存在时，后续的基因就会失活。质粒 pTet-Splice 含有 Tet P 上游、SV40 剪切序列、多聚 A 信号下游及一个多克隆位点，在此编码所选择的目的基因可读框的序列可以很容易地插入。自主调控的 tTA 的表达是由质粒 pTet-tTAK 启动的，这个质粒中的 tTA 可读框（含有优化的翻译起始序列，Kozak 序列）已插入到质粒 pTet-Splice。

这个方法介绍用 pTet-tTAK 稳定转染贴壁细胞，以产生表达可诱导 tTA 的细胞系。

第一轮转染后，可产生仅仅表达可诱导 tTA 的稳定细胞系。也可以用此方案进行 pTet-tTAK 和表达靶基因的质粒稳定共转染。第二轮转染是用表达靶基因的质粒转染表达可诱导 tTA 的稳定细胞系。

实验前准备详见「其他」。

1. 用选择培养基（500 μmol/L L-组氨醇）培养可诱导表达 tTA 的稳定细胞系。转染前 1 天，用选择培养基（500 μmol/L L-组氨醇）接种适量的细胞于 10 cm 组织培养皿中，使在转染时细胞生长至 1/3 汇片。

2. 转染之前使质粒线性化，调节质粒浓度>0.5 mg/ml。

3. 用 500 μl HeBS 在干净的 4 ml 聚苯乙烯管混合 10~20 μg 每一目的基因质粒和 1~2 μg pPGKPuro （每一 tet 质粒与带选择标记质粒的摩尔数比例为 10:1）。

设立无 DNA的转染对照。在嘌呤霉素存在下（步骤 14） 所有的细胞都应死亡。嘌呤霉素（最低剂量内 0.1~10 μg/ml，这一剂量能够在几天内杀死所有没有转染的细胞）最佳的致死浓度应在 转染之前根据不同的细胞类型加以确定。

4. 向质粒 DNA 中加入 32.5 μl 2 mol/L 的 CaCl₂，立即轻轻振荡混匀。间歇轻轻振荡，在室温放置 15~30 min 让沉淀生成，或直至与装水的管相比有明显混浊。

5. 将培养基从细胞中吸出，一次做一个板子。用巴斯德枪头抽吸几次混匀沉淀，逐滴均匀地覆盖所有细胞。

6. 温育 30 min，15 min 后轻轻振摇平板，以确保均匀覆盖整个板子。

7. 向每个平板中加入 10 ml 含 500 μmol/L L-组氨醇的选择培养基，含或不含 25 μmol/L 氯喹（终浓度）。

8. 温育 4~5 h。

9. 轻轻地将培养基吸出，尽量不要触及位于细胞上的沉淀。逐滴加入 2.5 ml 预热的 85% HeBS/15% 甘油，休克处理细胞。

在甘油休克处理细胞前，特别是休克处理后看到细胞碎片是正常的现象。根据研究者操作的速度，可以同时休克处理 2~4 块板子。

10. 2.5 min 后将 HeBS/甘油吸出。快速操作，因为甘油对细胞的毒性很大。

根据不同的细胞类型，细胞暴露在甘油溶液中的时间长短是可以调节的，可以延长到 4~5 min 以得到最佳的转染效率。在导致最少细胞死亡的情况下应休克处理更长的时间。

11. 轻轻地、快速地清洗细胞 2 次，每次加入 500 μmol/L L-组氨醇的选择培养基，然后立即吸出。

将所有的培养基加到培养皿中的一个点上，以防培养皿中的细胞脱落。

12. 加入 10 ml 的 500 μmol/L L-组氨醇的选择培养基，温育过夜。

13. 转染后的第 2 天早上，吸出培养基，加入 10 ml 含 500 μmol/L L-组氨醇的选择培养基，继续温育。

14. 转染后 48 h，用含 3 μg/ml 嘌呤霉素（终浓度）和 500 μmol/L L-组 氨醇的选择培养基按上述的方法对细胞进行稀释。

嘌呤霉素（最低剂量为 0. 1~10 μg/ml，这一剂量能够在几天内杀死所有没有转染的细胞）最佳 的致死浓度应作转染之前根据不同的细胞类型加以确定。3 μg/ml 的嘌呤霉素对于筛选转染的 NIH3T3 细胞足足够的。

15.仅对第二轮：4 天后，用含 500 μmol/L L-组氨醇/嘌呤霉素的选择培养基培养细胞。

16. 当克隆形成完好（选择 12~14 天），环绕克隆四周做个标记。从培养皿中吸出培养基，将一个塑料克隆环环绕单独克隆放置。用 100 μl PBS 快速冲洗克隆，加 2 滴胰酶（100 μl） 处理 30 s~1 min。

从培养皿中挑选细胞，单独的克隆适度地分布于培养皿上很容易区分。

17. 同第一轮处理，将其转移到 1 ml 含 500 μmol/L L-组氨醇/嘌呤霉素的选择培养基中。

18. 当细胞长满时，用含 500 μmol/L L-组氨醇/嘌呤霉素的选择培养基 将细胞转移至 6 cm 的组织培养板中。

所有的胰酶消化均按照标准的方法进行，包括快速的 PBS 清洗，1~3 min 的胰酶/ EDTA 温育（每个生长至汇片的 10 cm 的培养板用 2 ml） 和用含 10% 牛血清的 500 μmol/L L-组 氨醇选择培养基（+/- 嘌呤霉素）稀释终止胰酶消化反应。

19. 经过诱导后通过 Northern 或免疫印迹检测目的基因的表达。将分装的细胞冻存于液氮中。此后细胞用含 500 μmol/L L-组氨醇/嘌呤霉素的选择培养基进行培养。

1. 所有的组织培养都在加湿的 5% CO₂ 培养箱中 37℃ 培养。

2. 每次转染需要一个培养皿。一个典型的实验应该包括 tTA 对照培养皿、tTA 和靶基因对照培养皿，以及非转染对照培养皿。

完全的 DMEM/tet：

完全的 DMEM-10 培养基，包括 0.5 μg/ml 盐酸四环素（Sigma；在 70% 的乙醇中稀释 10 mg/ml 储备，避光在 -20℃ 条件下保存）

选择培养基含 125 μmol/L、250 μmol/L 或 500 μmol/L L-组氨醇

第一轮或共转染所需的质粒：

pTet-tTAK (Life Technology) 和含 IE 基因可读框的质粒，靶基因克隆到 pTet-Splice (Life Technology)， PSV2-His 或其他有选择标记的质粒；经过 CsCl 或阴离子交换层析法纯化。

第二轮转染所需的质粒：

含靶基因可读框的质粒，靶基因克隆到 pTet-Splice (Life Technology)、pPGKPuro 或其他有选择标记的质粒；经过 CsCl 或阴离子交换层析法纯化

2mol/L CaCl₂

10 mg/ml 氯喹（19 mmol/L，选用，Sigma）; 用水稀释，在-20℃ 保存

85% HeBS/15% 甘油 37℃ 预保温

3 mg/ml 嘌呤霉素（Sigma） 用 PBS 稀释