印迹(blotting)

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印迹(blotting)是生物学实验中常用的检测和分析方法。印迹(blotting)实验的过程可以简单描述为将待检测的生物大分子 经电泳等方法分离后转移并固定在膜(如：硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜)上，然后用特异性识别物质(如探针 )去识别，最后经显色反应(同位素放射自显影、荧光、化学发光等)在膜上显示出结果------印迹。

最早出现的blotting技术是Southern Blotting，它是检测DNA的一种方法。这项技术由英国生物学家EdwinSouthern在20世纪70年代发明，科学界便以发明者的名字来命名这项技术------SouthernBlotting。1977年，美国斯坦福大学的JamesAlwine，DavidKemp，和GeorgeStark在PNAS 上发表文章，提出了类似于SouthernBlotting，但却是用来检测RNA的技术。由于跟Southern Blotting比较相近，于是便有了Northern Blotting这个名称。后来，GeorgeStark又发明了用于检测蛋白质的blotting技术，W. Neal Burnette玩了一把“文字游戏”将这项技术命名为WesternBlotting，这个名字很快也被广泛接受并流行起来。

其实，WesternBlotting与Southern Blotting、Northern Blotting的技术原理差别还是比较大的。这种差别体现在Southern Blotting和Northern Blotting是基于DNA和RNA分子之间碱基互补配对的特异性识别能力，而Western Blotting则基于抗原 抗体之间特异的免疫 反应。Southern Blotting和NorthernBlotting时使用带有标记(如同位素标记或荧光标记)的DNA或RNA探针去识别并结合到待检测核酸上，然后直接显影;而WesternBlotting时要先用待检测蛋白的“一抗”结合到待检测蛋白上，再用可识别“一抗”并偶联了某种酶的“二抗去检测”一抗“，最后通过显色反应的信号来显示待检测蛋白的存在与否及量的多少。

另外，Southern Blotting和Northern Blotting两者比较容易混淆。这两种技术最关键的区别在于待检测核酸的属性，如果被检测的是DNA，则该技术就是Southern Blotting，其探针可以是DNA也可以是RNA;类似地，如果被检测的是RNA，不管探针是RNA还是DNA，该方法就叫作Northern Blotting。

除了以上三种Blotting技术，还有两种不太常见的Blotting技术：EasternBlotting和Southwestern blot ting。

Eastern Blotting

是一种检测蛋白质翻译后修饰的技术，其检测目标是蛋白质上特定的修饰基团或部位，如脂肪酸链、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在EasternBlotting实验中，通常要先用2D电泳将蛋白质分离，然后转到膜上，再用特异的探针去检测。蛋白质的翻译后修饰是蛋白质执行功能过程中普遍存在的调控手段!

Southwesternblotting

是一种检测DNA和蛋白质互作的方法，因此才有Southwestern之称。首先用SDS-PAGE 的方法将蛋白质分离开来并转移到膜上，然后在尿素的存在下去除SDS使蛋白尽可能复性，最后用带标记的特定序列的DNA探针去检测。

以上简单介绍的几种Blotting技术都以检测某种生物大分子的存在(或量的多少)为目的，所使用的去识别待检测物质的探针或抗体与待检测物质之间的结合是已知的、确定的。在这一点上做文章，就可以把blotting技术推广到验证蛋白质相互作用这个领域。

Far-westernblotting是一种基于western blotting的分子生物学方法，在western blotting中用抗体来检测目标蛋白，而在far-westernblotting中用能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质。因此，westernblotting用来检测特定的蛋白而far-western blotting则用于检测蛋白质之间的相互作用。

在传统的western blotting中，凝胶电泳 被用来从样品中分离蛋白质，然后这些蛋白质在blotting过程中被转移到膜上。目标蛋白在westernblot中被抗体探针识别。far-western blotting用非抗体蛋白来检测目标蛋白，通过这种方式，与探针结合的蛋白质就被检测出来了。探针蛋白经常通过一种表达克隆 载体 在大肠杆菌 中被生产出来。

探针蛋白可以通过一种常规的方法------放射自显影显现出来，它可以结合像His或FLAG的特殊的亲和标签或者蛋白质的特殊抗体。因此在凝胶电泳前将细胞提取液在煮沸的去垢剂中失活是检测不需要自然折叠状态的蛋白质相互作用重要方法。