细胞基因组DNA制备

相关专题

实验原理：在去污剂SDS及EDTA存在下，通过蛋白酶K消化细胞蛋白质，RNA酶消化RNA获得细胞基因组DNA。本方法获得的DNA可用于Southern杂交及构建文库 。
一、实验材料：
1．细胞消化缓冲液：
100mM NaCL
10mM Tris·CL (PH=8.0)
25mM EDTA (PH=8.0)
0.5% SDS (生工)
0.1mg/ml蛋白酶K（储存液20mg/ml，在－20℃储存，临用前稀释添加） (Boehringer)
2．PBS
3．TE(PH=8.0)
4．酚：氯仿（1：1）
5．3M乙酸钠
6．100％乙醇和70％乙醇
7．1mg/ml胰RNA酶 (国产)
二、实验方法：
1．贴壁细胞经EDTA 消化成细胞悬液，1000rpm×5min离心收集细胞。
2．5ml冰预冷的PBS 重悬细胞沉淀，1000rpm×5min离心，重复两次最后去上清，混匀管底使细胞成悬液，加入细胞消化缓冲液（细胞数〈3×107，细胞消化缓冲液300ul；大量细胞时如108，细胞消化缓冲液1ml，应充分分散混匀）。
3．50℃振荡12－18小时。
4．等体积酚 ：氯仿(1 : 1)抽提消化液，10000rpm×5min离心。
5．用大口径移液器将上清液转移至新管，加入1/10体积乙酸钠和2倍体积无水乙醇，10000rpm×5min离心沉淀DNA。
6．70％乙醇洗沉淀然后晾干（不可完全干燥，否则极难溶解）。
7．50－150ul TE（含1mg/ml胰RNA酶）溶解沉淀。
三．实验结果鉴定标准：
1．测OD值，260nm与280nm的比值应大于1.75，DNA浓度应大于0.14ug/ul。
2．通过EcoR I酶做部分消化，电泳观察DNA长度。
四．参考文献：
1．Ausubel F. M., Brent R., et al, 1995, Preparation and Analysis of DNA.
In “Current Protocol in Molecular Biology”, 2, 21-23.