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哺乳动物基因组DNA制备

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一、目的及要求

1. 掌握提取基因组DNA的原理和方法、步骤。

2. 了解相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

二、实验原理

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:(1)防止和抑制DNase对DNA的降解;(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动物基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150kb,适用于噬菌体构建基因组文库和Souther分析。

三、仪器与耗材

仪器:台式离心机、玻璃匀浆器、高压灭菌锅、恒温水浴器、微量取样器和吸头、无菌过滤器、10mL注射器

耗材: Eppendorf管、吸头

四、试剂

1. 0.5M Tris-HCl(pH8.0)

2. 0.5M EDTA(pH 8.0)

3. 5MNaCl

4. 3M NaAc(pH 5.2)

以上均高压灭菌

5.鼠肝

6.组织匀浆液:100mMNaCl,10mM Tris-HCl(pH8.0),25 mM EDTA(pH8.0)

7.酶解液:200mMNaCl,20mM Tris-HCl(pH8.0),50 mM EDTA(pH8.0),200μg/mL蛋白酶K,1%SDS

8.TE缓冲液:1 mM EDTA (pH8.0),10 mM Tris-HCl (pH8.0)

9.蛋白酶K:10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤,-20℃保存。

10.RNA酶:将胰RNA酶溶于10mM Tris-HCl(pH7.5),15mMNaCl溶液中,浓度10mg/mL,于100℃水浴处理15min以降解DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存。

11.λDNA/EcoRI+HindIII marker

12.酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(体积比)

13.氯仿:异戊醇=24:1(体积比)

14.5XTBE(5倍体积的TBE储存液)

Tris 54g

硼酸27.5g

总体积1000mL pH8.0

15.6X上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液

16.动物基因组DNA快速提取试剂盒

五、操作步骤(两人一组)

(一) 小鼠肝脏DNA制备

1.取200mg鼠肝,用冰块处理研磨直至无组织块存在。将粉末移入1.5ml离心管中加入1ml溶液B,震荡均匀,室温放置5分钟。

2.12000rpm离心5分钟。

3.将上清移入5ml离心管中,加入2.5ml溶液C,20ml溶液A,50ml溶液D,充分混匀,室温放置20分钟。

4.10000r/min离心5min,弃上清。

5.加入溶液C,充分混匀,10000r/min离心2min,弃上清。

6加入溶液E,充分混匀,10000r/min离心2min,弃上清

7.重复6步骤

8.12000r/min离心2min,吸干上清,室温干燥(不要太干,否则DNA不易溶解)。

9.取溶液F200μL ,混匀,40-50℃水浴5分钟。

10.12000rpm离心2分钟,上清即是实验动物基因组DNA。

(二) 电泳检测

由于基因组DNA分子质量较大,用0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,先在底部铺一层1%的支持胶,凝固后在铺上一层0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(不能碰到支持胶)。取1.5μL溶解的DNA、1μL上样缓冲液和3.5μL无菌水混匀后小心上样观察基因组DNA大小。

六、注意事项

1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验(如Southern 杂交、PCR等)目的。如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化。
 

(责任编辑:大汉昆仑王)
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