利用碱裂解法提取与纯化质粒DNA

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质粒

细菌 质粒 是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒 都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体 之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体 外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂 传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆 的载体 分子 ，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子 。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法 提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析 、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针 标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

一、试剂准备

1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA (pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA (pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3. 溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5.苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)

6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)

7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8.溴化乙锭(EB)：10mg/ml

9.RNase A(RNA酶A)：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10. 6×loading buffer(上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。

11. 1% 琼脂 糖凝胶：称取1g琼脂 糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽 中(电泳缓冲液0.5×TBE)，即可上样。

二、操作步骤

1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr)。

2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜 裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。

5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。

7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

9.沉淀溶于20μl TE(含RNase A 20μg/ml)，37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

三、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

四、注意事项

本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶 切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。