SDS碱裂解法制备质粒DNA（小量制备）
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原理
用碱和 SDS 处理可以从小量 ( 1~2 ml）细菌培养物中分离质粒 DNA，所获得的质粒则可以用电泳或限制性核酸内切酶消化的方法鉴定；经聚乙二醇处理进一步纯化后，其可以用做 DNA 测序反应的模板。
材料与仪器
碱裂解液 抗生素 乙酵 酚 氯仿 STE TE
LB、YT 或 Terrific 培养液
LB、YT 或 Terrific 培养液
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) 碱裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4℃。
(2) 碱裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（从 10 N 贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。
(3) 碱裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中钾的浓度为 3 mol/L，乙酸根的浓度为 5 mol/L。保存于 4℃，用时置于冰浴中。
(4) 用于筛选质粒的抗生素
(5) 乙酵
(6) 酚：氯仿（1:1, V/V)
(7) STE
(8) TE ( pH 8.0 ) ：含 20 μg/ml RNase A
2. 培养基
LB、YT 或 Terrific 培养液。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑转化后的单菌落，接种到 2 ml 含有适当抗生素的丰富培养基中（LB、YT 或 Terrific 培养液 )，于 37℃ 剧烈振摇下培养过夜。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖紧；培养物应在剧烈振摇下培养。
(2) 将 1.5 ml 培养物倒入微量离心管，用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 30 s，将剩余的培养物贮存于 4℃。
(3) 离心结束，尽可能吸干培养液。
除去上清的简便方法是用一次性吸管或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连。轻微抽吸，并使吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，以尽量避免沉淀被吸到侧臂烧瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液，并用吸头除去管壁上附着的液滴。
未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制酶切割或不能完全切割。这是因为培养液中的细胞壁成分抑制多种限制酶的活性。这个问题可这样解决：用冰预冷的 STE ( 菌液体积的 0.25 倍）重悬细菌沉淀并离心。
2. 细胞的裂解
(1) 将细菌沉淀重悬于 100 μl 冰预冷的裂解液液Ⅰ中，剧烈振荡。
为确保细菌沉淀在碱裂解液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。
(2) 加 200 μl 新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内容物，切勿振荡！将离心管放置于冰上。
应确保离心管的整个内壁均与碱裂解液Ⅱ接触。
(3) 加 150 μl 用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅱ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3~5 min。
(4) 用小离心机于 4℃ 以最大转速离心 5 min，将上清转移到另一离心管中。
(5) （选用）加等量体积的酚：氯仿，振荡混合有机相和水相，然后用小离心机于 4℃ 以最大速度离心 2 min。将上清转移到另一离心管中。
有些研究者认为不必用酚：氯仿抽提。然而，这一步骤的省略可能会导致获得不能被限制酶切割的 DNA。用氯仿抽提的目的是从水相中除去残余的酚。酚在水中微溶，但能被氯仿抽提到有机相中。几年前在一些实验室中，通常用闻气味的方法检査 DNA 制品中残留的酚。该方法不宜提倡。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 用 2 倍体积的乙醇于室温沉淀核酸，振荡混合，于室温放置 2 min。
(2) 用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 5 min，收集沉淀的梭酸。
最好养成总是用同一种方式在离心机中放置离心管的习惯，例如，按顺序放置，将离心管的塑料柄朝外。沉淀总是在离转头中心最远的离心管内壁聚集。知道 DNA 沉淀在什么地方可以较容易地找到可见的沉淀，也就能有效地溶解看不见的沉淀，在离心管的侧面及顶部都做好标记，这样即使字迹棋糊了也能辨识各管。
(3) 按上述步骤 3 所述小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出排干，用 Khnwipe 或一次性吸头除去管壁上的液滴。
(4) 加 1 ml 70% 乙醇于沉淀中并将盖紧的试管顛倒数次，用微量离心机在 4℃ 以最大转速离心 2 min，回收 DNA。
(5) 再次用步骤 3 所述的方法轻微抽吸除去所有的上清。
(6) 除去管壁上的酒精液滴，将开口的试管应置于室温使酒精挥发，直至试管内没有可见的液体存在（5~10 min)。
如果用干煤器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987）。将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(6) 用 50 μl 含有去 DNA 酶的 RNA 酶 A ( 胰 RNA 酶）（20 μg/ml）的 TE 重新溶解核酸，温和振荡几秒钟，贮存于 -20℃。
1. 缓冲液和溶液
(1) 碱裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4℃。
(2) 碱裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（从 10 N 贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要现用现配，室温下使用。
(3) 碱裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸钾 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中钾的浓度为 3 mol/L，乙酸根的浓度为 5 mol/L。保存于 4℃，用时置于冰浴中。
(4) 用于筛选质粒的抗生素
(5) 乙酵
(6) 酚：氯仿（1:1, V/V)
(7) STE
(8) TE ( pH 8.0 ) ：含 20 μg/ml RNase A
2. 培养基
LB、YT 或 Terrific 培养液。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 挑转化后的单菌落，接种到 2 ml 含有适当抗生素的丰富培养基中（LB、YT 或 Terrific 培养液 )，于 37℃ 剧烈振摇下培养过夜。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖紧；培养物应在剧烈振摇下培养。
(2) 将 1.5 ml 培养物倒入微量离心管，用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 30 s，将剩余的培养物贮存于 4℃。
(3) 离心结束，尽可能吸干培养液。
除去上清的简便方法是用一次性吸管或巴斯德吸管与一个真空管道和一个侧臂烧瓶相连。轻微抽吸，并使吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，以尽量避免沉淀被吸到侧臂烧瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培养液，并用吸头除去管壁上附着的液滴。
未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制酶切割或不能完全切割。这是因为培养液中的细胞壁成分抑制多种限制酶的活性。这个问题可这样解决：用冰预冷的 STE ( 菌液体积的 0.25 倍）重悬细菌沉淀并离心。
2. 细胞的裂解
(1) 将细菌沉淀重悬于 100 μl 冰预冷的裂解液液Ⅰ中，剧烈振荡。
为确保细菌沉淀在碱裂解液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。
(2) 加 200 μl 新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内容物，切勿振荡！将离心管放置于冰上。
应确保离心管的整个内壁均与碱裂解液Ⅱ接触。
(3) 加 150 μl 用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅱ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3~5 min。
(4) 用小离心机于 4℃ 以最大转速离心 5 min，将上清转移到另一离心管中。
(5) （选用）加等量体积的酚：氯仿，振荡混合有机相和水相，然后用小离心机于 4℃ 以最大速度离心 2 min。将上清转移到另一离心管中。
有些研究者认为不必用酚：氯仿抽提。然而，这一步骤的省略可能会导致获得不能被限制酶切割的 DNA。用氯仿抽提的目的是从水相中除去残余的酚。酚在水中微溶，但能被氯仿抽提到有机相中。几年前在一些实验室中，通常用闻气味的方法检査 DNA 制品中残留的酚。该方法不宜提倡。
3. 质粒 DNA 的回收
(1) 用 2 倍体积的乙醇于室温沉淀核酸，振荡混合，于室温放置 2 min。
(2) 用微量离心机于 4℃ 以最大转速离心 5 min，收集沉淀的梭酸。
最好养成总是用同一种方式在离心机中放置离心管的习惯，例如，按顺序放置，将离心管的塑料柄朝外。沉淀总是在离转头中心最远的离心管内壁聚集。知道 DNA 沉淀在什么地方可以较容易地找到可见的沉淀，也就能有效地溶解看不见的沉淀，在离心管的侧面及顶部都做好标记，这样即使字迹棋糊了也能辨识各管。
(3) 按上述步骤 3 所述小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出排干，用 Khnwipe 或一次性吸头除去管壁上的液滴。
(4) 加 1 ml 70% 乙醇于沉淀中并将盖紧的试管顛倒数次，用微量离心机在 4℃ 以最大转速离心 2 min，回收 DNA。
(5) 再次用步骤 3 所述的方法轻微抽吸除去所有的上清。
(6) 除去管壁上的酒精液滴，将开口的试管应置于室温使酒精挥发，直至试管内没有可见的液体存在（5~10 min)。
如果用干煤器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性（Svaren et al. 1987）。将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
(6) 用 50 μl 含有去 DNA 酶的 RNA 酶 A ( 胰 RNA 酶）（20 μg/ml）的 TE 重新溶解核酸，温和振荡几秒钟，贮存于 -20℃。
来源：丁香实验
