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【资源】实验一 质粒DNA的小量制备

丁香园

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最近在做质粒提取方面的实验,搜集了相关资料与大家分享,这是传统提质粒的方法,与试剂盒提质粒不同,通过这个过程大家可以更好的明白实验原理。
1.目的
学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2.原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性,但两条互补链彼此互相盘绕,仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时,共价闭合环状质粒DNA复性快,而线性的染色体DNA复性缓慢,经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3.器材
超净工作台,接种环,酒精灯,台式离心机,旋涡混合器,微量移液取样器,1.5ml微量离心管,恒温摇床,摇菌试管,双面微量离心管架,试管架,标签纸,磁力搅拌器等。
4.试剂
Pinpoint™xa-3质粒载体菌,pBS-CHI载体菌,LB培养基1000ml(含100µg/ml氨苄青霉素),葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液(溶液 I),NaOH/SDS溶液(溶液 II),KAc溶液(pH4.8)(溶液 III),RNase A,95%乙醇,70%乙醇,TE buffer(pH8.0)。
5.实验准备
氨苄青霉素储存液(无菌水配制5mg/ml,分装后-20°C保存),配制LB培养基(胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解,用约200ml 5N NaOH调pH至7.0,加ddH2O至1L,121°C 20min灭菌);溶液I(50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris HCl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0);溶液II(0.2mol/L NaOH,1% SDS);溶液III(60ml 5mol/L Kac,加冰乙酸调pH4.8,补dd H2O至100ml),75%乙醇(-20°C保存),TE buffer(10mmol/L Tris HCl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0);10mg /ml RNase A(RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5,15mmol/L NaCl中);摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒,一起高压灭菌(121°C 30min)。
6.操作步骤
(1在超净工作台中取5ml LB(Ampr),加入灭菌的摇菌试管中。
(2从超低温冰箱中取出保存Pinpoint™xa-3载体的菌种和pBS-CHI的菌种(操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中,切不可将菌融化!),在超净工作台上用烧红的接种环刮一下,再把接种环于无菌LB培养液(含100µg/ml氨苄青霉素)中搅拌一下,37°C摇床中摇12~16h。Pinpoint™xa-3菌: 接种于5ml LB(Ampr); pBS-CHI菌:接种于2ml LB(Ampr)。
(3)取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中,15000rpm离心1min,弃上清液(尽量弃干净),留沉淀备用。Pinpoint™xa-3菌:3管(3×1.5ml); pBS-CHI菌:1管(1.5ml)。
(4)在沉淀中加入100µl 溶液I,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀,室温下静置5min。(等待的同时,取一个塑料盒,装上适量的冰块备用。)
(5)加入200µl 溶液II,盖上盖后上下颠倒几次混匀,插入冰中,放置5min。
(6)加入150µl 溶液III,盖上盖后上下颠倒几次混匀,插入冰中,放置5min。
(7)15000rpm离心5min,小心吸取400µl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中,(不要将白色沉淀物带入!),加入800µl 无水乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀,室温下静置5min。
(8)15000rpm离心10 min,小心弃掉上清液,加入500µl 75%乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min,小心弃掉上清液,尽量倒置弃干净。
(9)再加入500µl 75% 乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min,小心弃掉上清液,尽量倒置弃干净。
(10)离心管倒置于37°C培养箱中(或室温)空气干燥。(管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见!)。
(11)pBS-CHI加入30µl 无菌蒸馏水或TE缓冲液; 3管质粒中每管加入10µl蒸馏水混匀后收集到一个管中,涡旋混合器上混匀,在离心机中瞬时转一下,使溶液集中在管底。待电泳确认(见实验二)后再在Pinpoint™xa-3质粒中加入1µl RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。
(12)清理桌面,清洗仪器,撰写实验报告。
7.思考
(1)影响本实验结果的因素有哪些?
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