质粒DNA的小量制备

（一）细菌的收获和裂解

１．收获

１）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
　　２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
　　３）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

３．煮沸裂解

该法根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成。

１）将细菌沉淀[收获细菌和步骤３）所得]重悬于350μlSTET中。
　　STET
　　0.1mol/L NaC
　　10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
　　1mmol/L EDTA(pH8.0)
　　5% Triton X-100

２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡３秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。
　　３）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。
　　４）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。
　　５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
　　６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置５分钟。
　　７）用微量离心机于4℃以12 000g离心５分种，回收核酸沉淀。
　　８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
　　９）加1ml７０％乙醇，于4℃以12 000g离心２分钟。
　　10）按步骤８）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（２－５）分钟。
11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。

i．当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。

ii．此法制备的高考贝数质粒（如Ｘf3哉pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌增减物３－５μg。

iii．如果要通过限酶切割反应来分析DNA，可取１μlDNA溶液加到另一个含８μl水的微量离心管内，加１μl 10x限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温度温育１－２小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤３）或上述步骤８）未能很好地去除所有液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提DNA终产物，然后用乙醇重新沉淀DNA，通常，用5－10倍过量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200μl 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后， 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠（pH5.2)和２倍体积乙醇沉淀DNA。

（二）质粒DNA小量制备的问题与对策

裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：

１）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。

２）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。